小檗碱(Berberine)是一种常见的异喹啉生物碱,广泛应用于医药和农业领域。本文以三叶鬼针草(Bidens pilosa L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)和烟草BY-2悬浮细胞(Nicotiana tabacum Bright yellow-2)为材料,研究了小檗碱的生物活性、吸收传导和作用机理,为小檗碱作为一种新的植物源除草剂的应用提供理论基础和科学根据。小檗碱、草甘膦(Glyphosate)、二甲戊灵(Pendimethalin)和2,4-D处理三叶鬼针草7 d后,对三叶鬼针草根长的IC50值分别是3.27、3.45、6.97和0.23 mg·L-1,对三叶鬼针草鲜重的IC50值分别是6.11、7.72、15.21和0.92 mg·L-1;小檗碱、草甘膦、二甲戊灵和2,4-D处理拟南芥7 d后,对拟南芥根长的IC50值分别是0.25、0.52、3.51和0.0024 mg·L-1,对拟南芥鲜重的IC50值分别是6.00、5.25、13.74和1.21 mg·L-1,可以看出,小檗碱对三叶鬼针草和拟南芥的室内除草活性与草甘膦和二甲戊灵相当。以0、5、10、20、40和80 mg·L-1的小檗碱处理烟草细胞1 d后,细胞死亡率分别为7.45%、9.90%、14.29%、30.99%、53.08%和63.76%;处理2 d后,细胞死亡率分别为8.52%、11.97%、19.69%、35.91%、60.36%和78.47%。对照药剂草甘膦在5、10、20、40和80 mg·L-1的浓度下处理烟草细胞1 d后,细胞死亡率分别为9.40%、20.03%、31.23%、43.18%和55.75%;处理2 d后,细胞死亡率分别为11.21%、26.08%、39.11%、48.03%和61.65%。可以看出,小檗碱对烟草细胞的活性与草甘膦相当。由于小檗碱具有和常用商品化除草剂草甘膦和二甲戊灵相当的室内生物活性,因此,研究小檗碱的吸收传导相关特性,对小檗碱的田间应用具有重要的指导意义。以32 mg·L-1的小檗碱通过水培、涂茎和涂叶等不同施药方式处理4~6叶期的三叶鬼针草幼苗,结果发现水培的植株被显著抑制,1、2、3、5和7 d,随着时间的增加,根长、株高、根鲜重和整株鲜重的抑制率持续上升,但涂茎和涂叶两种方法并没有造成明显抑制。采用水培法和叶片涂药法研究小檗碱在三叶鬼针草植株内的传导,通过HPLC分析,32 mg·L-1的小檗碱水培三叶鬼针草幼苗0.5、1、2、3、5和7 d后,根中小檗碱浓度分别为51.69、63.59、76.74、50.45、38.33和27.38μg·g-1,茎中小檗碱浓度分别为6.41、8.05、12.33、19.23、14.58和9.09μg·g-1,叶中小檗碱浓度分别为0、0、2.76、3.17、3.14和2.63μg·g-1,随着时间的延长,在根、茎、叶中均能检测到小檗碱;而采用叶片涂药法处理,经过0.5、1、2、3、5和7 d后,只在三叶鬼针草的叶部检测到小檗碱。由此可看出,小檗碱主要通过植物的根部吸收并进行传导,在三叶鬼针草植株内有自下而上的传导性,而没有自上而下的传导性。进一步用32mg·l-1的小檗碱通过水培法处理4叶期的三叶鬼针草0.5、1、2、3和5d后,切片后,采用荧光显微镜观察发现,小檗碱主要通过植物维管束从根向茎叶进行传导,结果表明小檗碱是通过质外体系传导。以模式植物拟南芥为实验材料进行作用机理初步研究表明,小檗碱能显著抑制拟南芥主根的生长,使拟南芥根尖分生区皮层的细胞数量显著减少。由于生长素在根形态建成中具有重要意义,所以我们推测小檗碱可能对根部细胞分裂素和生长素运输系统产生了影响。以野生型拟南芥及其生长素响应元件转基因系(dr5:gus)和细胞周期蛋白转基因系(cycb1:gus)为实验材料研究发现,小檗碱影响了生长素在拟南芥根尖部位的分布和含量,影响了cycb1在拟南芥根部的表达,且研究结果还提示小檗碱除草可能与对照药剂草甘膦和二甲戊灵,存在截然不同的作用机制,值得深入研究。以拟南芥pin1:gfp和pin2:gfp标记系为实验材料研究发现,10mg·l-1小檗碱影响了pin1和pin2在根尖的表达量,并使pin1丧失在细胞膜上的极性定位功能。进一步的rt-pcr研究发现,小檗碱对pin1、iaa14、air1、aux1、pin3和pin7基因的转录表达能够产生一定的影响。同时研究发现2mg·l-1的小檗碱可使拟南芥根尖分生区内皮层的细胞数量显著减少,但在此浓度下,对生长素在根尖的分布和含量的影响并不十分明显,所以我们推测,植物最初响应小檗碱的靶标可能并不在生长素信号转导系统。由于小檗碱导致pin1丧失在细胞膜上的定位功能,由此推测,其作用位点可能位于细胞膜系统。因此,以烟草细胞为实验材料进一步研究了小檗碱对细胞膜的影响。以0、5、10、20、40和80mg·l-1小檗碱处理烟草细胞8h后,以流式细胞仪测定了烟草细胞线粒体膜电位的变化,细胞平均荧光强度值分别为92.80、89.31、89.87、87.79、76.64和72.34,随着浓度的升高,处理组荧光强度峰均有所下降,其中40和80mg·l-1处理的与对照差异显著,小檗碱对烟草细胞线粒体膜电位影响显著,但并不能诱导烟草细胞凋亡,可以看出,小檗碱对细胞膜系统产生了影响。在此基础上,进一步研究了小檗碱对细胞膜组成成分的影响。采用12.5~200mg·l-1的小檗碱水培处理8叶期的三叶鬼针草植株后,收集根部样品,用gc-ms测量样品中脂肪酸的含量,在三叶鬼针草根中,脂肪酸组分最多的是棕榈酸(c16)和硬脂酸(c18),约占总脂肪酸的55%,小檗碱能显著的影响根中脂肪酸的含量;经12.5~50 mg·L-1的小檗碱处理后,IUFA百分比逐渐增大,但浓度从50~200 mg·L-1逐渐升高时IUFA百分比逐渐减少,结果表明,一定浓度的小檗碱会造成三叶鬼针草不可逆变化,IUFA百分比持续下降,从而影响细胞膜的流动性,造成质膜过氧化。进一步研究小檗碱对细胞形态和超微结构影响结果表明,烟草细胞经小檗碱处理后采用DAPI染色研究发现,高浓度的小檗碱(40和80 mg·L-1)严重影响了烟草细胞细胞核的形态,细胞核出现不规则形状、颗粒化等。通过SEM(扫描电镜)和TEM(透射电镜)分析三叶鬼针草和拟南芥的根尖表面及分生区细胞,发现0.5 mg·L-1的小檗碱可使拟南芥分生区细胞中的线粒体数量明显减少,随着小檗碱浓度的增加,可以使根尖表面出现明显的凹陷和分生区细胞坏死等。TEM分析小檗碱对烟草细胞影响的结果表明,随着小檗碱浓度的增加及处理时间的延长,烟草细胞变形和质壁分离现象越来越明显,线粒体和细胞壁等的降解也越明显。综上所述,植物源除草化合物小檗碱具有与草甘膦和二甲戊灵相当的室内除草活性。其主要作用位点在植物根部,由根吸收后自下而上传导,先引起根部的生长受到抑制,随后可引起整株的生长受到抑制。小檗碱能显著影响植物细胞分裂,影响生长素输出载体蛋白PIN1在细胞膜上的极性定位功能,引起线粒体膜电位的变化,破坏根部IUFA的平衡,引起细胞膜质过氧化。小檗碱虽然不能引起植物细胞凋亡,但可引起植物细胞直接坏死。植物响应小檗碱的最初靶标可能是线粒体。