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成釉细胞瘤(ameloblastoma，AM)是最常见的颌骨良性牙源性肿瘤，其局部侵袭及复发的分子生物学机制至今尚未完全明确。体外培养的肿瘤细胞是研究肿瘤侵袭机制的重要手段，AM细胞在体外培养条件下经历数次增殖即进入凋亡状态，存活时间短暂，使AM细胞作为实验对象的研究受到限制。因此，建立稳定的、克隆化的具有AM细胞表型和功能的细胞株已成为急需。近年来日本学者Harada和本课题组陶谦教授分别使用脂质体法转染HPV16E6/E7和SV40大T抗原的方法尝试建立永生化AM细胞株，转染后细胞能够较稳定的增殖传代，同时仍保持了上皮细胞的特性。尽管两位学者的实验各有一定不足，如：它们均为DNA肿瘤病毒诱导的细胞株，两种外源性基因并不参与AM发生及发展的过程，有可能引起某些细胞表型的改变等，但以上研究为AM细胞永生化提供了实验的可能和经验。
研究表明，端粒动力学(telomere dynamics)是正常及肿瘤组织发生、发展过程的重要调节因素。正常细胞不表达端粒酶活性，端粒在分裂过程中进行性缩短，最终导致细胞进入端粒控制的衰老状态(telomere—controlled senescence)也称M1(Mortality1)，是细胞进入永生化的关键障碍。端粒酶活性主要的调节因素是其逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)蛋白组份，激活端粒酶可使细胞重新获得端粒长度维持机制，继而获得永生性转化。本实验通过构建含人端粒酶逆转录酶(human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)基因的逆转录病毒载体，感染细胞激活端粒酶，成功建立永生化AM细胞株并初步探讨其永生化机制，克服了前期学者研究的缺点，为研究AM发生发展以及侵袭等生物学特点提供了有价值的体外模型。
材料和方法：
1.参照分子克隆技术构建含有hTERT基因的逆转录病毒载体pLXSNneo—hTERT，用脂质体法将pLXSNneo—hTERT转染至PA317细胞，经G418药物压力筛选，建立产毒的PA317病毒包装细胞系，测定病毒滴度。
2.收集手术切除的AM肿瘤组织，组织块法进行细胞原代培养，肿瘤细胞爬出后常规消化传代，采用差速消化法去除肿瘤细胞中混杂的成纤维细胞，免疫细胞化学(Immunocytochemistry，ICC)鉴定细胞的上皮来源。
3.收集病毒包装PA317细胞的培养上清液，感染AM细胞，G418筛选抗性克隆，扩增培养，建立永生化AM细胞株。
4.采用倒置显微镜观察细胞形态；ICC检测广谱细胞角蛋白(PAN—cytokeratin，pCK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)表达；绘制细胞生长曲线；计算细胞群体倍增时间(Doubling Time，DT)及群体倍增数(Population Doublings，PDL)，绘制细胞倍增曲线：细胞衰老β—半乳糖苷酶(Senescence Associatedβ Galactosidase，SA—β—Gal)染色检测细胞衰老；端粒重复序列扩增(Telomeric repeat amplification，TRAP)—银染法检测转染前后AM细胞中端粒酶活性表达；两步法逆转录—聚合酶链反应(Reverse transcription—polymerase chainreaction，RT—PCR)检测转染前后AM细胞中hTERT、p16、p21和p53基因的表达情况；Western blot检测转染前后AM细胞中hTERT、p16、p21和p53蛋白的表达情况；以106个细胞接种裸鼠检测肿瘤形成。
结果：
1.双酶切鉴定及测序结果显示pLXSNneo—hTERT重组逆转录病毒载体构准确无误，转染PA317细胞获得病毒包装细胞，测定病毒滴度符合转染条件。
2.原代培养的AM细胞于肿瘤组织块贴壁24h后开始爬出，呈典型的“铺路石”样，ICC鉴定pCK阳性、Vim阴性。
3.转染后AM细胞保持了上皮细胞特性，细胞生长曲线及倍增曲线表现出无限细胞株的特点，PDL值超过100；SA—β—Cal染色未见阳性衰老信号；不同PDL值的细胞均可表达端粒酶活性；裸鼠致瘤实验未见成瘤。
4.相比未转染细胞，RT—PCR检测hTERT基因在转染后AM细胞中表达，而p16则在转染后AM细胞中表达丢失；而p21与p53在转染前后AM细胞中均有表达。
5.Western Blot结果显示hTERT在朱转染AM细胞中基本无表达，而在转染后AM细胞中出现p16表达丢失；p21与p53在转染前后AM细胞中均有表达。
结论：
1.成功构建pLXSNneo—hTERT逆转录病毒载体。
2.获得含hTERT基因重组逆转录病毒的高病毒滴度产毒细胞系。
3.建立永生化AM细胞株，该细胞株具有上皮细胞特性，具有稳定端粒酶活性表达，可在体外稳定持续增殖，为研究AM侵袭机制提供可靠的体外模型。
4.本研究证实p16失活有可能是AM细胞永生化的重要机制，而p21与p53的表达则说明此细胞株并未获得恶性转化表型，仍保持良性肿瘤行为，但p16在永生化AM细胞株中的具体失活状态还需进一步研究。