【摘 要】
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紫杉醇是一种来源于红豆杉植物的天然抗癌活性物质,其作用机制通过促进微管蛋白聚合、防止微管的解聚达到抗癌效果,已广泛用于乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等多种癌症的临床治疗。紫杉醇每年的市场总价值超10亿美元,其需求量不断增加。然而红豆杉的紫杉醇含量极低（0.014%）,直接从红豆杉植物中提取成本高且破坏环境,而使用微生物发酵法与植物细胞培养法获取紫杉醇还存在许多技术性难题,目前依旧是依靠化学半合成法为
【基金项目】
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广东省科技计划项目（港澳联合创新领域）前沿与关键技术创新项目（2014B050505018）——制备巴卡亭Ⅲ的合成生物学工程前沿技术研究；
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紫杉醇是一种来源于红豆杉植物的天然抗癌活性物质,其作用机制通过促进微管蛋白聚合、防止微管的解聚达到抗癌效果,已广泛用于乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等多种癌症的临床治疗。紫杉醇每年的市场总价值超10亿美元,其需求量不断增加。然而红豆杉的紫杉醇含量极低（0.014%）,直接从红豆杉植物中提取成本高且破坏环境,而使用微生物发酵法与植物细胞培养法获取紫杉醇还存在许多技术性难题,目前依旧是依靠化学半合成法为主要生产紫杉醇的方式。巴卡亭Ⅲ是化学半合成紫杉醇的主要原料,同时也是紫杉醇生物合成途径中重要的前体物质。10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（10-deacetylbaccatinⅢ-10-O-acetyltransferase,DBAT）是催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatinⅢ,10-DAB）生成巴卡亭Ⅲ的关键限速酶。10-DAB在红豆杉叶子中含量较高,且叶子可再生利用。因此从红豆杉的叶子中提取10-DAB作为原料,构建含有DBAT酶的微生物细胞工厂来制备巴卡亭Ⅲ,能解决紫杉醇合成的原料问题,待紫杉醇生物合成途径完全解析,紫杉醇的微生物细胞工厂化生产有望成为最有前景的方式。本研究以本课题组前期对DBAT的相关研究作为基础,主要研究巴卡亭Ⅲ在微生物体内的合成,结合计算机的辅助技术,分别开展了DBAT酶非天然底物拓展的探究,以及通过蛋白质半理性设计改善DBAT酶的热稳定性,结合代谢工程思路改善乙酰辅酶A在微生物细胞内的利用效率,大大提高巴卡亭Ⅲ的合成量,最后将dbat基因整合至大肠杆菌染色体中实现无抗性无诱导的微生物细胞工厂化一步合成巴卡亭Ⅲ。以下是本论文主要的研究成果:1、建立了在大肠杆菌高效表达DBAT酶的体系,同源建模预测了DBAT酶的三维结构模型,利用本论文构建的开放式全细胞-破碎前系统筛选了包含14种乙酰基化合物的乙酰基底物谱,结合计算机技术获得选择规则:一个有效的乙酰基供体替代物应是一个具有乙酰基的化合物,具有适合的主链长度,且支链尽量多,但不包含环状结构。结果表明以N-乙酰氨基葡萄糖作为乙酰基底物时,开放式全细胞-破碎前系统反应获得巴卡亭Ⅲ生成量为2.25±0.39μM;体内合成反应获得巴卡亭Ⅲ生成量为17.98±0.35μM;大肠杆菌表达系统BL21（DE3）/p ET-32a-DBAT为最适用于合成巴卡亭Ⅲ的表达系统。2、建立了以葡萄糖引导的全细胞筛选体系用于多策略蛋白质半理性设计工程改造DBAT酶。利用分子动力学模拟能量平衡验证关键位点His162为活性中心,预测关键位点Arg365起盖子功能防止底物逃逸。利用分子对接技术、定点突变技术,基于催化三联体的特征为活性口袋引入亲核体,构建了N42C、G167S、N42CG167S和P37DN300HV302S四个突变体,突变体反应合成巴卡亭Ⅲ的生成量低于野生型,突变对活性口袋带来负面影响,推测这些位点对DBAT酶的催化功能起重要作用。结合Hotspot Wizard 3.0构建热稳定性小型突变库,并结合位点饱和突变,获得突变体S189V合成巴卡亭Ⅲ的生成量是野生型的3.81倍,且S189V的热稳定性比野生型更高,S189C是野生型的3.32倍,S189L是野生型的3.15倍。3、利用突变株S189V,在25℃下以葡萄糖作为碳源的体内合成巴卡亭Ⅲ反应中,巴卡亭Ⅲ的生成量为24.72±0.28μM,是野生型菌株的4.25倍。优化发酵液的碳源以提高细胞代谢过程中乙酰辅酶A通往合成巴卡亭Ⅲ的分流,结果表明以甘油作为碳源时巴卡亭Ⅲ的生成量提高至44.60±0.94μM（提高1.8倍）。通过改变宿主进一步提高乙酰辅酶A的利用率,结果表明代谢工程改造菌N05积累乙酰辅酶A的能力比BL21（DE3）更强。以N05作为发酵宿主,同等甘油添加量下巴卡亭Ⅲ的生成量提高至54.51±2.24μM,持续增加甘油添加量,当甘油添加量达到20 g/L时,巴卡亭Ⅲ的生成量达到73.93±0.05μM,是DBAT酶改造以及宿主改变和碳源优化前的12.7倍。4、利用染色体工程将dbat基因以及突变型基因（s189v和p37q）分别整合至大肠杆菌BW25113和N05的染色体中,使基因得到稳定遗传。HPLC检测结果显示,6个工程菌均能产生巴卡亭Ⅲ,其中N05S01(N05,att PHK::[PT5-s189vo])发酵获得的巴卡亭Ⅲ生成量最高,为45.34±0.32μM,实现了微生物细胞工厂化一步制备巴卡亭Ⅲ。
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