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PTEN(与细胞骨架张力蛋白同源在肿瘤第10号染色体有缺失的磷酸脂酶基因),也叫MMAC1(在多个进展期肿瘤中均有突变的基因),是一种抑癌基因,位于染色体10q23区,负责编码磷酸酯酶。已发现在多种人类癌症中PTEN抑癌基因的缺失。在胃癌的PTEN基因丢失,但并未有报道此基因有高频突变。另一方面,Smad-4是唯一共同通路型Smad(Co-Smad)蛋白,有研究认为Smad-4作为一个抑癌基因通过TGF-β(转化生长因子β)来介导相关信号转导。Smad-4被发现在胃癌等多种癌症中丢失或发生突变。在本论文中,我们研究了在人胚肾293T和恶性胃癌MGC-803两种细胞系中,Smad-4和TGF-β对抑癌基因PTEN表达的调控作用。通过荧光素酶双报告基因分析,经转染过表达Smad-4的293T细胞中PTEN基因的启动子活性显著增加,表明PTEN启动区和SMAD-4蛋白之间存在一定的相互作用。经转染带有Smad-4过表达质粒的人胚肾293T细胞,在有或无TGF-β1的情况下,都表现出上调PTEN的mRNA和蛋白表达水平;然而,转染Smad-4并同时用TGF-β1处理的细胞中PTEN才得以最终表达。同时,通过siRNA技术干扰Smad-4的表达,发现表现出下调PTEN的mRNA和蛋白表达水平。染色质免疫沉淀(ChIP)的结果显示Smad-4蛋白与PTEN启动子之间有三个结合作用位点。另外,发现在恶性肿瘤中Smad-4和TGF-β的抑癌作用与正常细胞中有所不同,正如很多研究中都提到过关于不同细胞系中TGF-β或Smad-4对PTEN表达调控的争议问题。对于转染有Smad-4表达质粒的人恶性胃癌MGC-803细胞,在有或无TGF-β1的情况下,均导致PTEN的mRNA和蛋白表达水平下调;转染Smad-4并同时用TGF-β处理的细胞中PTEN的表达减少。许多之前的报告中提到活性RAS致癌基因及其下游在胃癌发生中的作用。本文中,我们先用MEK抑制剂PD98059处理MGC-803细胞,之后再转染Smad-4并施加TGF-β1信号。蛋白免疫印迹和RT-PCR实验结果表明:细胞再次开启了PTEN基因的表达;同时经Smad-4转染和TGF-β信号处理,PTEN得以最大限度表达。我们的数据显示RAS/ERK信号通路在肿瘤细胞中处于活化状态,而MEK抑制剂PD98059的使用又使其被抑制。此外,分别检测了MGC-803细胞的胞质和核片段中Smad-4的含量,结果显示经MEK抑制剂处理同时施加TGF-β1信号的细胞中Smad-4蛋白的位置改变进入到细胞核中。因此,抑制RAS/ERK信号通路恢复了TGF-β的信号转导,从而实现Smad-4促进PTEN的表达抑制状态转化为表达上调。综上,在正常293T细胞中Smad-4通过TGF-β信号诱导PTEN的表达。然而这种调控作用在胃癌MGC-803细胞中却是对PTEN表达的下调或是抑制作用,这可能是由于活化的RAS/ERK信号通路阻止了Smad-4的转运入核进而影响对PTEN的诱导表达。再通过抑制RAS/ERK信号通路,PTEN的表达得以恢复。