目的:细胞衰老在阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease,AD）的发病中起着重要作用,但与AD发生发展的关系及机制尚未完全阐明。β淀粉样蛋白（β-Amyloid pr otein,Aβ）是AD患者大脑病理变化的关键因素,Aβ是否加速脑细胞,尤其是星形胶质细胞衰老以及这种衰老是否会损害认知功能及机制仍不清楚,针对衰老细胞的治疗是否能延缓AD病程尚待研究。因此,本研究主要是选用原代培养的星形胶质细胞（Astrocytes,AS）、APPswe/PS1d E9双转基因模型小鼠（B6.Cg-Tg）（APP/PS1）等为研究对象,明确APP/PS1转基因小鼠随着月龄的增加脑细胞衰老情况及衰老细胞类型,通过体内体外实验探讨细胞衰老在AD发病机制中的作用及Aβ是否可能通过诱导或促进细胞衰老而发挥其神经毒性及其机制;探讨ABT263（也称navitoclax,抗凋亡蛋白的特异性抑制剂,特异性诱导衰老细胞凋亡）对APP/PS1转基因鼠脑衰老细胞的清除,以及清除衰老细胞后对AD进程的影响及可能机制,为AD的临床治疗提供理论依据;通过设计的载体系统靶向清除APP/PS1鼠脑组织中衰老星形胶质细胞,探讨其靶向清除后对AD进程的影响及可能机制,进一步探讨星形胶质细胞衰老在AD发病机制中的作用,为AD发病机制及临床治疗研究提供理论及治疗靶点依据。方法:1.细胞实验部分:（1）Aβ诱导AS细胞衰老实验:用Aβ寡聚体（Aβoligomer,AβO）、半乳糖（D-gal）、PI3K通路抑制剂LY294002等分别或联合处理培养的原代AS细胞;采用β半乳糖苷酶染色（Senescence Associatedβ-Galactosidase,SA-β-Gal）检测衰老阳性细胞;实时荧光定量PCR法检测细胞中衰老相关通路蛋白p16、p21、p53m RNA表达水平;WB法检测细胞中衰老相关通路蛋白p16,p21,p53、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine-protein kinase,AKT）、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞上清液中白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）、基质金属蛋白酶1（Matrix metalloproteinase-1,MMP-1）表达水平的变化;流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期以及活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的变化情况;（2）诱导凋亡载体系统的构建及验证:基于雷帕霉素（Rapamycin）诱导的FKBP12与FRB结构域的连接以及二聚体AP20187（B/B Homodimerizer）对FKBP的二聚作用,分别构建FKBP-2A-td Tomato（发出红色荧光）及FRB-Cas8-2A-BSD两个质粒,通过Lip2000将上述质粒转染至293T细胞、AGS细胞、U251细胞、K562细胞,加入不同浓度的AP20187、Rapamycin处理,荧光显微镜观察红色荧光细胞情况,流式细胞术检测细胞凋亡。（3）靶向清除衰老星型胶质细胞载体系统的构建:在上述诱导细胞凋亡载体系统基础上,分别以细胞衰老特异蛋白p16及星型胶质细胞标志蛋白Aldh1l1启动下游蛋白表达,构建两个慢病毒载体（Lenti p16-FKBP-2A-td Tomato,Lenti Aldh1l1 Promoter-FRB-Cas8-2A-BSD）,感染D-gal诱导的衰老小鼠星型胶质细胞（Mouse Astrocytes,m AS）,经AP20187及Rapamycin处理后,荧光显微镜下观察红色荧光细胞情况,流式细胞术检测细胞的凋亡。2.动物实验部分:（1）APP/PS1双转基因模型小鼠脑细胞衰老及相关指标检测:采用免疫组织化学方法,检测不同月龄APP/PS1双转基因小鼠及对照组脑中Aβ的表达及分布;Morris水迷宫测定各组小鼠空间学习及记忆能力;苏木素伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色评估各组小鼠脑组织病理学改变;SA-β-Gal染色检测衰老阳性细胞;实时荧光定量PCR法检测APP/PS1双转基因小鼠海马及皮质衰老相关通路蛋白p16、p21、p53 m RNA表达水平;WB法检测APP/PS1双转基因小鼠海马及皮质组织中衰老相关通路蛋白p16,p21,p53、磷酸化PI3K,AKT,GSK-3β、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达;ELISA检测小鼠海马组织中IL-6、IL-8、MMP-1表达水平的变化;（2）ABT263清除APP/PS1双转基因小鼠脑衰老细胞实验:选用6、12月龄APP/PS1双转基因小鼠,给予50mg/kg/天ABT263先灌胃处理5天,中间休息两周,再灌胃处理5天。采用免疫组织化学方法,检测APP/PS1双转基因小鼠及对照组大脑中Aβ的表达;HE染色评估各组小鼠脑组织病理学改变;Morris水迷宫测定各组小鼠空间学习及记忆能力;SA-β-Gal染色检测衰老阳性细胞;实时荧光定量PCR法检测APP/PS1双转基因小鼠海马组织中衰老相关通路蛋白p16、p21、p53 m RNA表达水平;WB法检测APP/PS1双转基因小鼠海马组织中衰老相关通路蛋白p16,p21,p53磷酸化PI3K,AKT,GSK-3β、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Bcl-x L的表达;ELISA法检测小鼠海马组织中IL-6、IL-8、MMP-1表达水平的变化;（3）靶向清除APP/PS1双转基因小鼠脑衰老星形胶质细胞实验:构建并包装两个腺相关病毒（AAV p16-FKBP-2A-td Tomato、AAV Aldh1l1-FRB-Cas8-2A-BS D）,将病毒通过侧脑室注射处理12月龄的APP/PS1的双转基因小鼠;再经AP20187、Rapamycin先后处理,采用免疫组织化学方法,检测APP/PS1双转基因小鼠及对照组大脑中Aβ的表达;免疫荧光检测各组小鼠中发出红色荧光的细胞与Aldh1l1、Neu N、Iba1、Olig2在脑组织中的共定位表达;SA-β-Gal染色检测衰老阳性细胞;WB法检测APP/PS1双转基因小鼠皮质组织中衰老相关通路蛋白p16,p21,p53、磷酸化PI3K,AKT,GSK-3β、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达;ELISA法检测小鼠皮质组织中IL-6、IL-8、MMP-1表达水平的变化;结果:1.细胞实验结果:（1）Aβ诱导细胞衰老实验结果:结果显示,Aβ处理原代培养AS后衰老阳性细胞数明显增加,p16表达水平增加,p PI3K、p AKT、p GSK-3β、Bcl-2蛋白的表达水平降低,Bax蛋白表达水平增加。IL-6、IL-8、MMP-1水平有不同程度的增高,细胞凋亡率和ROS水平也增加,细胞周期主要阻滞在G2/M期。同时Aβ能进一步增强D-gal诱导的细胞衰老及自然衰老AS细胞衰老。LY294002及Aβ联合处理原代培养的AS细胞,与对照组相比,LY294002处理组细胞内的p16、p21蛋白表达水平减少,p53无明显变化,而Aβ处理组细胞p16、p21蛋白表达水平则增加;与12 Days+Aβ组相比,经LY294002预处理组p16、p21蛋白表达水平减少,p53蛋白表达水平无明显变化。（2）诱导凋亡载体系统的构建及结果:a.诱导凋亡载体系统诱导细胞凋亡:通过Lip2000将构建的FKBP-2A-td Tomato及FRB-Cas8-2A-BSD质粒共转染至293T、AGS、U251、K562细胞中,荧光显微镜下确定细胞发出红色荧光（td Tomato）;转染后的细胞用AP20187、rapamycin处理后,用荧光显微镜观察发现与转染组比（未经AP20187和rapamycin处理）发出红色荧光细胞数量明显减少,流式细胞术检测结果发现细胞凋亡率明显增加。b.靶向清除衰老星形胶质细胞结果:经p16-FKBP-P2A-td Tomato感染D-gal诱导的m AS细胞后,细胞发出明显红色荧光,说明该质粒能标记细胞衰老;p16-FKBP-2A-td Tomato及Aldh1l1-FRB-Cas8-2A-BSD感染D-gal诱导的m AS、293T及AGS细胞均会发出红色荧光,经AP20187、rapamycin联合处理后,发出红色荧光的m AS细胞明显减少,细胞凋亡率增加,而发出红色荧光的293T及AGS细胞无变化,细胞凋亡率无变化。说明该载体系统能诱导衰老m AS凋亡,从而达到靶向清除的目的。2.动物实验结果:（1）APP/PS1双转基因小鼠脑细胞衰老及相关指标改变结果:a.从6月龄开始,APP/PS1双转基因小鼠出现学习记忆能力下降,其下降程度与月龄呈正相关;免疫组化结果显示,从6月龄开始,在APP/PS1双转基因小鼠海马及皮质中出现Aβ的沉积,并且随着月龄的增加,逐渐增多,野生型小鼠直到18月龄时才出现少量的Aβ沉积;免疫荧光结果发现星形胶质细胞和少突胶质细胞出现衰老,未见神经元和小胶质细胞衰老。b.SA-β-Gal染色结果显示,在4月龄APP/PS1组小鼠脑组织内即开始出现衰老的阳性细胞,从6月龄开始,APP/PS1双转基因小鼠脑组织内出现少量斑块样的衰老阳性细胞沉积,早于Aβ沉积的出现,随着月龄的增加,衰老阳性细胞进一步增多,野生鼠从6月龄开始出现衰老的阳性细胞,也随着月龄的增加,衰老的阳性细胞数增多,但较少出现斑块样的衰老阳性细胞,且与同月龄APP/PS1小鼠相比明显减少。c.ELISA结果显示,从6月龄开始APP/PS1组小鼠海马组织中IL-6、IL-8、MMP-1表达升高,并随着月龄的增加显著增加;野生型小鼠从12月龄开始,IL-6、IL-8、MMP-1表达水平也有所升高。e.衰老相关蛋白及通路蛋白检测结果显示,与野生型小鼠相比,6月龄APP/PS1双转基因小鼠皮质及海马中p16 m RNA及蛋白水平升高,且随着月龄的增加显著增加;而p21 m RNA及蛋白水平仅在18个月龄的APP/PS1双转基因小鼠中表达增加;p53 m RNA水平则在12月龄时升高,而p53蛋白水平在各年龄段均无明显差异。从4月龄开始,APP/PS1双转基因小鼠海马及皮质中p PI3K、p AKT及p GSK-3β蛋白表达降低,并随着月龄的增加显著减低。从6月龄开始,APP/PS1双转基因小鼠海马和皮质中凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达降低,并随着月龄的增加显著减低,而Bax蛋白随着月龄的增加表达水平增加。（2）ABT263清除APP/PS1双转基因小鼠脑衰老细胞结果:在6月、12月龄小鼠中,与同月龄APP/PS1组相比,ABT263灌胃处理组小鼠学习记忆能力增强;脑内老年斑数量减少,聚集程度降低;SA-β-Gal染色阳性细胞数减少,阳性斑块聚集程度降低;海马组织中IL-6、IL-8、MMP-1表达水平降低;p16及p21 m RNA表达水平降低;磷酸化PI3K、AKT及GSK-3β蛋白表达水平增加;Bcl-2蛋白表达水平无明显变化,Bcl-x L蛋白表达水平进一步降低,Bax蛋白水平进一步升高。这些结果说明ABT263清除衰老细胞能够延缓APP/PS1小鼠病程及相关指标的改变,提高小鼠的学习记忆能力。（3）靶向清除APP/PS1小鼠衰老星形胶质细胞结果:经侧脑室注射腺相关病毒以及AP20187和Rapamycin处理后,与APP/PS1+AAV组（未经AP20187和Rapamycin处理）相比,脑内Aβ沉积明显减少,老年斑减少,SA-β-Gal染色结果提示衰老阳性细胞数明显减少;IL-6、IL-8表达水平减少,p16、p21蛋白表达水平降低,p PI3K、p AKT、p GSK-3β蛋白表达水平增加,Bcl-2增加、Bax蛋白表达水平降低。这些结果说明靶向清除APP/PS1小鼠衰老星形胶质细胞也能够延缓APP/PS1小鼠病理进程。结论:（1）Aβ能诱导原代培养AS衰老,可能与上调p16基因的表达水平、增加ROS、细胞凋亡及激活PI3K/AKT/GSK3β信号通路有关。（2）随着月龄的增加,APP/PS1小鼠脑衰老星型胶质细胞及少突胶质细胞增多、SASP衰老表型分泌增加、p16表达增加,星型胶质细胞衰老在Aβ沉积之前即已出现,说明星型胶质细胞衰老是AD脑细胞衰老的重要类型,在AD的发病机制中可能起着重要作用。（3）设计的诱导凋亡载体系统能通过FKBP与FRB的结合及FKBP二聚化使caspase8形成二聚体通过自我剪切而活化,从而诱导细胞凋亡。靶向诱导衰老星型胶质细胞的载体系统能起到荧光标记衰老细胞并特异性靶向清除衰老星型胶质细胞的作用。（4）ABT263清除APP/PS1小鼠脑内衰老细胞及靶向清除APP/PS1小鼠脑中衰老星型胶质细胞能减少脑内Aβ聚集以及炎性反应,激活PI3K-AKT-GSK-3β通路,延缓APP/PS1小鼠病理进程。