近年来,越来越多的研究证实血小板作为一种无核细胞能够进行程序性死亡。化学激动剂(包括凝血酶、胶原蛋白、ADP等)、氧化应激诱导的病理条件(包括高脂血症、2型糖尿病及尿毒症等)及物理性因素(体温过高、血流剪切力等)等条件均可诱导血小板发生凋亡。血小板凋亡在血小板依赖的生物学进程、血栓与止血及调控血小板寿命中扮演着重要的角色。在2型糖尿病患者中,动脉粥样和微血管病变是常见的并发症,包括高糖血症、血脂异常和脂氧化物、炎症因素及血小板高反应性在内的多种因素被认为参与到动脉粥样硬化的过程中。已有研究证实在2型糖尿病患者中存在着血小板反应性增加的情况,但是目前有关机制仍不明确。过多的血栓素A2合成、脂过氧化物及血小板活性增加被认为可能与2型糖尿病患者的血小板功能失调有关。目前有关2型糖尿病患者中血小板凋亡扮演的作用仍不明确。另外,糖尿病高脂血症是一种常见的糖尿病并发疾病,其发病原因是由糖尿病引起的脂质代谢出现异常,导致患者血浆内脂质水平超标。在目前的临床实践中,他汀类药物最常被用于控制血胆固醇,其被作为一线药物用于治疗冠心病及动脉粥样硬化,2型糖尿病等疾病合并血胆固醇升高时也常规使用。他汀类药物能够通过抑制3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A(hydroxymethy glutaryl coenzyme A,HMG-Co A)还原酶将HMG-Co A转化为甲羟钨酸,从而减少胆固醇的生成。他汀类药物被认为能够产生多种有益的效应,被报道能够诱导肿瘤细胞的凋亡并用于肿瘤的治疗。然而有研究认为,他汀类药物也能够产生副作用,血小板减少症就是其中之一,目前有关他汀类药物对血小板凋亡的效应仍不明确。在本文中,我们将聚焦于血小板凋亡这一生物学过程,通过分子细胞手段,明确2型糖尿病患者及他汀类药物导致的血小板凋亡的机制。第一部分2型糖尿病患者血小板凋亡及其相关机制的研究目的:观察2型糖尿病患者中血小板凋亡的情况并初步探索其相关的发生机制。方法:本研究共纳入25例确诊的2型糖尿病患者及11例年龄匹配的健康对照个体,记录这些个体的临床资料、在空腹时采集这些个体的静脉血并测定这些个体的血糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)的水平。通过离心法从采集的静脉血中获得富血小板血浆,分别采用流式细胞术检测钙离子载体A23187刺激后血小板磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻及线粒体跨膜电位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm)去极化,Western-blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3,Bcl-2及Bcl-XL等凋亡指标。进一步采用不同浓度(50-400μg/ml)的AGEs与健康个体的洗涤血小板进行孵育后,流式细胞术检测血小板磷脂酰丝氨酸外翻及线粒体跨膜电位去极化,Western-blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3及Bax的表达水平。结果:结果显示,相比于健康对照组个体,2型糖尿病患者血浆中AGEs的水平有显著的升高(p<0.05);血小板的线粒体跨膜电位显著下降。经钙离子载体A23187刺激后糖尿病患者来源血小板磷脂酰丝氨酸外翻相比于对照组有显著升高。Pro-caspase-3、Bcl-2及Bcl-XL水平相较于对照组有显著的下降,active caspase-3的表达则相较对照组有所上调。当健康的血小板采用不同浓度的AGEs刺激后,能够出现浓度依赖线粒体跨膜电位下降。高浓度的AGEs能够显著诱导血小板磷脂酰丝氨酸外翻,并且经免疫印迹检测显示经AGEs诱导后,洗涤血小板中active caspase-3及Bax的表达水平升高,并呈现浓度依赖的趋势。结论:研究表明2型糖尿病患者中血小板凋亡的现象相比于正常患者有所增加,2型糖尿病患者中显著升高的AGEs可能是导致血小板凋亡增加的重要原因。第二部分他汀类药物导致血小板凋亡及其相关机制的研究目的:明确他汀类药物洛伐他汀对血小板凋亡的诱导效应并探索其相关的机制。方法:通过采集健康人静脉血,分离获得洗涤血小板后,采用不同浓度的他汀类药物洛伐他汀(6.25μM-25μM)进行刺激后,流式细胞术检测血小板线粒体膜电位去极化明确血小板的凋亡。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bak、Bcl-XL及活化的caspase-3/9/8。随后将经不同浓度洛伐他汀刺激后血小板磷脂酰丝氨酸外翻的情况采用流式细胞术进行检测,通过p选择素及PAC-1的活化观察洛伐他汀对血小板活化的影响。在机制探索方面,利用中国仓鼠卵细胞(Chinese hamster ovary,CHO)细胞作为模型,通过采用整合素αIIbβ3拮抗剂RGDS处理后,流式细胞术检测CHO细胞线粒体膜电位去极化及细胞凋亡情况。将野生型及稳定表达整合素αIIbβ3的中国仓鼠卵母细胞采用洛伐他汀处理24 h后,流式细胞术检测细胞凋亡。最后通过建立小鼠体内实验模型,采用5 mg/kg的洛伐他汀进行腹腔注射后,采集外周血检测循环血小板的数量。结果:结果显示,洛伐他汀处理能够诱导血小板线粒体膜电位去极化,并呈现剂量依赖的效应,经免疫印迹检测显示Bak水平升高,Bcl-XL水平下降及caspase 3/8/9的活化。洛伐他汀处理不能增加血小板表面p选择素表达增加及PAC-1结合。经整合素αIIbβ3拮抗剂RGDS处理后,洛伐他汀诱导的血小板凋亡受到抑制;另外在稳定表达整合素αIIbβ3的CHO细胞中洛伐他汀诱导的凋亡现象较野生型显著增加。腹腔注射洛伐他汀的小鼠循环血小板的数量会出现显著的下降。结论:研究表明他汀类药物洛伐他汀能够通过caspase依赖的途径诱导血小板凋亡。另外洛伐他汀并不会引起血小板的活化,但能够体内减少循环血小板的数量,结果提示采用他汀类药物治疗高脂血症产生副作用的可能机制。