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肿瘤耐药是治疗失败的重要原因,而GST为肿瘤产生耐药的重要靶点。GST可通过催化抗癌药与GSH的加合和排出,也可与凋亡途径关键蛋白因子结合抑制凋亡。GST高亲和力抑制剂可逆转耐药。前期设计双依他尼酸乙二胺(EDEA),其同工酶选择性为GSTM2>GSTA1>GSTP,对GSTM2抑制能力可达到纳摩级,且对肺癌和卵巢癌均有一定增敏作用,但发现具有一定的毒性。乙醇胺是体内合成胆碱的重要原料,本文用乙醇胺为连接臂连接双分子依他尼酸合成双依他尼酸乙醇胺(Aminoethanol Di-Ethacrynic Acid,ADEA),评价其GST抑制活性和细胞及在体毒性和增敏作用。首先,初速度法表征ADEA其与还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)加合物的GSTA1、GSTP1、GSTM2选择抑制作用和抑制类型,荧光滴定法测定结合比和结合动力学。ADEA本身对GSTM2的IC50是29nmol/L,比GSTA1低300倍,比GSTP1低3000倍;ADEA与GSH加合物的IC50分别降低了5、57和200倍。ADEA本身和GSH加合物对GSTM相对于底物CDNB为反竞争性抑制剂,ADEA本身对GSTM相对于底物GSH为混合性抑制剂,ADEA与GSH加合物对GSTM相对于底物GSH为反竞争性抑制剂。ADEA原位生成加合物对GSTM荧光静态淬灭结果表明为二价抑制剂;ADEA本身结合速度比加合物慢10倍。说明ADEA是有效的GSTM选择性二价潜抑制剂。选择三组耐药及敏感细胞,以ADEA为探针,通过肿瘤细胞裂解液GST酶活对ADEA抑制响应,解析耐药肿瘤细胞裂解液GST对各浓度ADEA抑制的敏感活性差异及活性亚型:据ADEA加合物对各亚型IC50差异,GSTM活性为对10 nmol/L以下ADEA响应敏感的酶活部分。SKOV3/DDP比SKOV3总酶活提高2倍、GSTM提高4倍;SGC7901/DDP比SGC7901总酶活降低1.2倍、GSTM降低无显著差异;A549/DDP与A549相比,总酶活降低了3倍、GSTM活性降低2倍。CCK-8测定IC10比较ADEA与EDEA对正常胚肾HEK293、肝脏LO2、肺上皮BEAS-2B、神经胶质细胞HEB、心肌细胞AC16的毒性。ADEA对HEK293、BEAS-2B的IC10为2.0μmol/L;对AC16低于1μmol/L;对三者的低毒剂量与EDEA相近;ADEA对LO2的IC10约为1.9μmol/L,比EDEA毒性低一倍;但对HEB为0.3μmol/L,比EDEA高3倍。1μmol/L ADEA与DDP联用时对肝细胞LO2无增敏,而1μmol/L EDEA增敏1.6倍。所以ADEA肝毒性减少了,而神经毒性增加,可能与其脂溶性增加导致血脑屏障透过性增加相关。在ADEA对正常肝肾细胞低毒剂量(2.0μmol/L)时,ADEA对SKOV3/DDP、SGC7901/DDP、A549/DDP分别增敏3.1、1.3、6.9倍,与EDEA对正常肝肾细胞低毒剂量(1.0μmol/L)比较,对SKOV3/DDP、SGC7901/DDP增敏作用相当,对A549/DDP增敏作用有所减弱。可能与作用于蛋白结合形式GST有关。流式细胞术和Hoechest233342比较ADEA和EDEA与DDP联用对肿瘤细胞的凋亡影响。两种药与DDP联用对三种细胞均有促凋亡作用,其中两种抑制剂对SKOV3/DDP、A549/DDP的促凋亡作用相当,但ADEA对SGC7901/DDP的促凋亡作用较EDEA低。Transwell和划痕实验发现ADEA、EDEA对SKOV3/DDP、SGC7901/DDP的迁移均不产生影响。采用共振光散射法及荧光淬灭法测定ADEA、EDEA在不同缓冲液中的溶解度及与BSA的结合能力,均表明ADEA水溶性较小,但与BSA的结合强于EDEA。考察增溶剂甘油、吐温-80对溶解度影响,选用0.2%的吐温-80制备注射用制剂。采用裸鼠皮下种植SGC7901/DDP 14天成瘤后,随机分组。与生理盐水组比较,处理1-2周观察,EDEA组、EDEA+DDP组的肿瘤体积增长速率显著降低;24天后停止用药,与DDP组相比,EDEA联用组对SGC7901/DDP裸鼠的瘤体积存在显著差异,瘤重差异不显著,与生理盐水组和EDEA单独用药组比较,瘤体积和瘤重差异不显著。综上所述,新设计双依他尼酸乙醇胺经酶学表征未GSTM2选择性的二价潜抑制剂。以此为探针,表征耐药瘤细胞裂解液尤其是SKOV3/DDP中GSTM活性及总酶活增加。ADEA单用和与DDP联用对肝脏毒性较EDEA减小,但对HEB细胞毒性相对较大。ADEA在低毒剂量下对耐药肿瘤细胞SKOV3/DDP、SGC7901/DDP和低毒剂量EDEA增敏作用相当,对A549/DDP稍弱,但高浓度ADEA增敏作用比EDEA弱。EDEA与DDP联用对SGC7901/DDP移植瘤裸鼠模型的增敏有限,进一步说明EDEA对耐药卵巢癌的选择性增敏作用,预计AEDE有相似的体内增敏作用。