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目的:课题组前期实验结果表明P-gp(P-glycoprotein,P-gp)过表达能增加大鼠胰岛β细胞株(INS-1)高糖刺激下胰岛素的分泌,并不影响胰岛素的生物合成,但其中的具体机制尚不清楚。本研究在进一步探讨P-gp过表达促进INS-1细胞胰岛素分泌的机制的同时,通过构建大鼠胰岛β细胞特异性P-gp过表达模型,观察体内环境中P-gp过表达对胰岛β细胞分泌、分化、增殖以及凋亡的影响。方法:(1)实验对象为INS-1细胞和SD大鼠胰岛;(2)INS-1细胞:将Ad-abcb1b腺病毒和阴性对照病毒以浓度50×106/m L在无血清培养基中感染INS-1细胞4小时后,换成正常含有胎牛血清的培养基,置于培养箱继续孵育44小时;(3)用弱RIPA萃取细胞总蛋白,胞浆/胞膜蛋白提取试剂盒萃取细胞膜蛋白和浆蛋白,Western Blot法检测P-gp、L型钙离子通道蛋白(Cav1.2)、小窝蛋白-1(CAV1)、PKA、CREB、SNAP25、STX1A、SYT1、p-CREB、GAPDH、Tublin等相关蛋白的表达;(4)应用染色质免疫沉淀(Ch IP)方法检测CREB与Cav1.2启动子之间是否有结合,并通过实时定量荧光PCR(q PCR)判断其结合的强度;(5)通过免疫共沉淀(Co-IP)方法检测P-gp与CAV1、SNAP25之间的相互作用关系;(6)通过荒漠区基因随机插入法(Ins2-Abcb1b)在大鼠体内构建胰岛P-gp过表达动物模型;(7)用胶原酶体外消化胰腺法人工挑取大鼠胰岛,培养过夜后进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验,并通过ELISA方法测定胰岛素分泌量;(8)提取细胞和胰岛组织总RNA,逆转录成c DNA后进行实时定量荧光PCR检测与β细胞分化相关基因Pdx1、Ins1、Ins2、Ngn3、Mafb、Nkx6.1、Nkx2.2、Neurod1、Mafa、Pax6等的表达情况;(9)取大鼠新鲜的胰腺组织,经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋、切片,用免疫组织化学法检测胰岛组织P-gp、caspase3、caspase8、caspase9、BCL-2、Ki67等相关蛋白的表达,用TUNEL法检测胰岛组织内细胞凋亡。结果:(1)INS-1细胞中,与对照组(Ad-control)相比,P-gp过表达组(Ad-abcb1b)细胞膜、细胞浆Cav1.2表达增加,但是细胞膜/细胞浆比值未增加(P>0.05);(2)与对照组相比,P-gp过表达组p-CREB、PKA定量增加,差异具有统计学意义(P<0.05);(3)Ch IP实验结果表明INS-1细胞内CREB与Cav1.2有结合,且P-gp过表达后CREB与Cav1.2结合增加(P<0.05);(4)Western Blot结果显示:与对照组相比,P-gp过表达组CAV1、SNAP25表达增加(P<0.05),STX1A和SYT表达未见明显差异(P>0.05);P-gp与CAV1、SNAP25具有相互作用,与STX1A无相互作用;随着P-gp表达的增加,P-gp与CAV1相互作用增加(P<0.05)、与SNAP25的相互作用减少(P<0.05);(5)与对照组相比,P-gp过表达后,INS-1细胞Ngn3、Mafb转录水平升高(P<0.05),Mafa转录水平降低(P<0.05),Pdx1、Ins1、Ins2、Nkx6.1、Nkx2.2、Neurod1、Pax6等基因的表达差异无统计学意义(P>0.05);在野生型和转基因大鼠胰岛组织中,各基因转录水平均无明显差异(P>0.05);(6)与野生型大鼠相比,过表达P-gp的转基因大鼠胰岛GSIS水平无明显变化(P>0.05);(7)免疫组化结果:与野生型大鼠相比,转基因大鼠胰岛组织caspase3、caspase8、caspase9、BCL-2、Ki67等的表达差异无统计学意义(P>0.05);(8)TUNEL结果:与野生型大鼠相比,转基因大鼠胰岛组织凋亡水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:体内外实验初步表明P-gp过表达对胰岛β细胞表型的影响包括:1.P-gp通过增加Cav1.2的表达促进INS-1细胞胰岛素分泌,与Cav1.2的膜转位无关;P-gp可能通过PKA/CREB途径调节Cav1.2的表达。2.P-gp过表达增加CAV1、SNAP25的表达;P-gp与CAV1和SNAP25具有相互作用;P-gp与CAV1相互作用的增加导致P-gp与SNAP25之间的相互作用减少,以释放更多的SNAP25参与INS-1细胞的胰岛素分泌。3.P-gp过表达可能使INS-1细胞去分化,而对胰岛β细胞的分化无明显影响。4.大鼠胰岛P-gp过表达对胰岛β细胞的GSIS、凋亡、增殖无明显影响。