泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）参与体内异常蛋白的清除,是生物体内重要的蛋白质清除系统。泛素化是泛素在某些酶（泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3等）作用下,将细胞内的蛋白质进行特异性修饰及靶向分类的过程。已泛素化的蛋白被26s蛋白酶体系统识别后加以降解。26s蛋白酶体是由20s催化亚基和19s调节亚基组成。因此,UPP在调控体内蛋白的定位和功能等方面都起着非常重要的作用。有研究表明,UPP对精子发生过程中细胞器和蛋白质的降解发挥着十分重要的作用。果蝇有32个蛋白酶体亚基,其中约三分之一具有由旁系同源基因编码的精巢特异性表达型。在这类亚基中,每个亚基的一种形式在所有发育阶段和所有组织中广泛表达,这些被称为“常规蛋白酶体亚基”,而其他亚型都是精巢特异性表达,它们可能在精子发生过程中进行动态组装。有研究表明,精巢特异性蛋白酶体与其他组织蛋白酶体的功能在性质上没有太大差别,它们可能具有微妙的功能,在介导精子发生过程中快速的蛋白质降解方面更有效。Rpt4属于蛋白酶体19s调节亚基中AAA+超家族ATPase亚基之一。本文主要研究的是精巢特异性表达调节亚基Rpt4R（Regulatory particle triple-A ATPase 4-related）,是Rpt4（Regulatory particle triple-A ATPase 4）相对应的精巢特异性表达的亚基。沃尔巴克氏体（Wolbachia）是一种胞内共生菌,可以对昆虫宿主产生多种影响,其中包括细胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility,CI）,即感染Wolbachia的雄性昆虫和未感染或者感染不同品系Wolbachia的雌性昆虫交配后,后代胚胎致死,不能进行正常发育。本课题组前期通过一系列研究发现,Wolbachia能影响宿主某些基因表达,进而导致果蝇精子发生过程产生缺陷。有研究报道,在感染Wolbachia的细胞中蛋白质的泛素化增强。故此我们通过Western blot实验发现,与未感染Wolbachia果蝇（Dmel T）精巢相比,感染Wolbachia果蝇（Dmel wMel）精巢中蛋白泛素化增强。将差异泛素化蛋白条带进行蛋白质鉴定,发现其中包括Rpt4R等多个蛋白。经qRT-PCR检测发现,与未感染果蝇相比,Rpt4R在一日龄Dmel wMel果蝇精巢中的表达水平显著升高（p＜0.05）,由于Wolbachia能够修饰雄性宿主精子进而破坏雄性育性,我们推测Rpt4R可能与雄蝇育性有关。为了验证感染Wolbachia使Rpt4R表达上调是否与Wolbachia诱导产生的CI有关,在感染Wolbachia的果蝇精巢中敲降Rpt4R,然后将敲降后的雄蝇[bamGal4;Rpt4R-hp（I+）]与正常雌蝇交配,统计雌蝇胚胎孵化率。结果显示:胚胎孵化率由44.42±3.30上调至61.47±0.86,表明Wolbachia感染导致Rpt4R表达上调,且泛素化Rpt4R聚集。这可能是Wolbachia感染导致昆虫宿主产生CI的原因之一。为了研究Rpt4R在果蝇生殖过程中的作用,我们通过RNAi在果蝇精巢中对其进行敲降。结果显示:Rpt4R敲降雄蝇与正常雌性果蝇交配后,子代孵化率极显著低于对照组（p＜0.01）;此外,与Rpt4R敲降雄蝇交配后的雌蝇产卵量极显著下降（p＜0.01）。为了进一步研究Rpt4R影响雄性果蝇育性的机制,我们采用免疫荧光染色技术对Rpt4R敲降精巢中精子发生过程进行分析。DAPI染色显示,Rpt4R在精巢中敲降后,精巢顶端产生1-数个异常大的生殖腺肿瘤样包囊,精巢靠近末端的位置精子束散乱,储精囊成熟精子数量相比于对照组明显减少,大约是对照组的25%。由于有文献显示,Rpt4R在体细胞或在精子发生的早期阶段没有表达,在64圆形精子合胞体的细胞质和细胞核中以及延伸的包囊细胞中均显著表达。于是为了探究精巢顶端大包囊中是哪种细胞的聚集,我们采用Vasa以及FasⅢ抗体进行免疫荧光染色。结果显示,精巢顶端的中心（Hub）细胞表达均正常,而生殖细胞数量较对照组减少,特别是在肿瘤样包囊位置处完全没有Vasa抗体的信号,表明其中不是生殖细胞。由于Rpt4R敲降产生的部分表型与prosα6T,DuBa,poe基因突变体表型相似,我们采用qRT-PCR方法检测了Rpt4R敲降对这些基因表达量的影响。结果显示:在Rpt4R敲降精巢中,prosα6T基因表达量极显著升高（p＜0.01）,DuBa和poe基因表达量显著降低（p＜0.05）。初步判断,Rpt4R敲降影响这些基因的表达,从而可能影响了果蝇精子发生过程。综上所述,Rpt4R在精子发生过程中发挥重要的作用,进而影响了果蝇的雄性育性。