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目的:神经生长因子(NGF)是20世纪50年代初在小鼠肉瘤细胞内发现的第一个神经营养因子。神经生长因子在中枢和外周神经系统的生物效应主要是:维持和促进交感神经及来自神经嵴的感觉神经细胞的存活、分化、成熟以及执行功能,并参与损伤神经的再生和功能的修复[1]。神经生长因子(NGF)神经营养因子中发现最早,目前研究最为透彻的,具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子,它在中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达上起着重要的调控作用。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种肝素结合活性的生长因子,它是由2个相同多肽链通过二硫键构成的同源二聚体糖蛋白。血管内皮因子主要在血管发育、生成以及心脑缺血过程中发挥着非常重要的作用,常常被作为血管内皮细胞的特异因子而广泛用于多种缺血性疾病治疗研究。VEGF在脑缺血损伤过程中发挥着非常重要的作用,其中包括保护神经元、促进新生血管形成、增强血管通透性、抑制细胞凋亡及参与脑内葡萄糖转运的作用。
相关资料报道缺血性脑血管病引起的痴呆(VD)是迄今为止唯一可以防治的痴呆[3],早期治疗会具有可逆性。缺血性脑血管病引起的痴呆是血管性痴呆的主要形式,短暂性脑缺血或缺血后再灌注最易引起人和动物海马CA1区神经元损伤,进而发生迟发性神经元死亡,被认为是VD的机制之一[2]。因此,探索VD发病的相关因素和发病机制,寻找早诊断、早预防、早治疗的有效办法具有重要的社会和医学意义。许多研究证实NGF和VEGF能保护缺血半暗带神经元,并能抑制迟发性神经元坏死。脑缺血时,NGF和VEGF与其受体结合,产生相应的效应分子对缺血神经元起保护作用。NGF和VEGF对神经元的生存、分化、生长起重要作用,促进其损伤后的再生,维持神经系统的生存及功能,可调节海马突触传递和突触可塑性,改善受损的学习记忆能力[4],在改善认知功能方面起着重要的作用。NGF和VEGF在中枢神经系统疾病中的作用日益被重视,或许会为血管性痴呆的治疗开辟新的方向。
方法:将60只28-32克健康雄性昆明小鼠随机分为以下6组(n=10):
(1)正常组:正常健康小鼠,不做任何处理。
(2)Sham组:仅暴露其双侧颈总动脉,但不阻断血流。
(3)VD模型1天组:参考李巍等制作方法[5],分别暴露其双侧颈总动脉,双侧颈总动脉夹闭,每次夹闭30分钟,反复三次,每次间隔10分钟,尾动脉放血0.3ml,。模型制作24小时后取材。
(4)VD模型7天组:模型制作方法同VD模型1天组,7天后取材。
(5)VD模型14天组:模型制作方法同VD模型1天组,14天后取材。
(6)VD模型28天组:模型制作方法同VD模型1天组,28天后取材。
每组动物在相同环境下饲养。其中正常组动物直接于饲养后,其余各组动物于术后分组时间点取材,分别进行Western blot,PCR分析,观察海马NGF和VEGF的变化情况。
结果:
1.Western blot结果
以上各组均以Western免疫印迹分析法检测小鼠海马区NGF的表达,
通过NGF与β-actin免疫条带的积分光密度(integral optical density,IOD)比值表达NGF的相对表达量,比值越大,说明表达越多。
结果:正常组小鼠可见海马区NGF蛋白的基础表达。与正常组相比,Sham组NGF的表达均无明显变化。而与正常组和Sham组相比,VD模型1天组,7天组,14天组,28天组NGF的表达明显升高(P＜0.05),且1天组和7天组NGF的表达分别显著高于14天组,28天组(P＜0.05)。上述结果表明,NGF在VD模型组小鼠海马的表达明显升高,且在VD模型后1天,7天时NGF的表达急剧升高,14天,28天时NGF表达虽有所回落,但表达量仍高于正常组和Sham组。
以上各组均以Western免疫印迹分析法检测小鼠海马区VEGF的表达,以VEGF与β-actin免疫条带的积分光密度(integral optical density,IOD)比值表达VEGF的相对表达量,比值越大,表达越多。
结果:正常组小鼠可见海马区VEGF蛋白的基础表达。与正常组相比,Sham组VEGF的表达均无明显变化。而与正常组,Sham组相比VD模型1天组,7天组,14天组,28天组,VEGF的表达明显升高(P＜0.05),且1天组和7天组NGF的表达分别显著高于14天组,28天组(P＜0.05)。上述结果表明,VEGF在VD模型组小鼠海马的表达明显升高,且在VD模型后1天,7天时VEGF的表达急剧升高,14天,28天时NGF表达虽有所回落,但表达量仍高于正常组和Sham组。
2.RT-PCR结果
正常组和Sham组大鼠海马NGFmRNA和VEGFmRNA有一定表达。与正常组相比,Sham组NGF和VEGF mRNA表达均无明显变化。而与正常组,Sham组相比VD模型1天组,7天组,14天组,28天组,NGFmRNAF和VEGFmRNA的表达明显升高(P＜0.05),且1天组和7天组NGFmRNA和VEGFmRNA表达分别显著高于14天组,28天组(P＜0.05)。上述结果表明,NGFmRNA和VEGF mRNA在VD模型组小鼠海马的表达明显升高,且在VD模型后1天,7天时NGFmRNA和VEGFmRNA的表达急剧升高,14天,28天时NGFmRNA和VEGFmRNA表达虽有所回落,但表达量仍高于正常组和Sham组。
结论:
在VD的发病过程中可以看到海马区NGF与VEGF及其mRNA的表达呈现出持续增高的趋势,且NGF和VEGF的变化成一定的相关性。