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目的:骨髓基质干细胞在体外诱导为成骨细胞后表面MHC抗原表达类型。探讨同种异体MSCs移植的可行性,为其在临床的应用提供依据。
方法:本试验以新西兰兔为试验动物,抽取其骨髓组织,在体外分离、培养,得到骨髓基质干细胞。形态观测:通过倒置显微镜动态观察体外培养的兔骨髓基质干细胞的形态及生长情况的变化。测标志物:取体外培养的第二代细胞,免疫组化法检测MSCs CD44表面标志物表达。制生长曲线:取生长良好的第2代细胞消化制备单细胞悬液,计数,调整细胞浓度为1×105/ml,接种于24孔细胞培养板中,每皿接种2ml,置于CO2孵箱进行培养,从接种后48小时开始,每日取出三孔,0.25%胰酶消化,计算每个培养皿中的细胞数,取均值。连续观察8天,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。
骨髓基质干细胞体外诱导为成骨细胞:在体外培养的第二代骨髓基质干细胞加入含BMP-2的诱导培养基在2周后,检测骨钙蛋白的表达,用来证实MSCs已经被诱导为成骨细胞。
骨髓源性成骨细胞在体外MI-IC抗原表达:将成骨细胞消化并接种于两个6孔培养板,细胞贴壁生长后,以相间隔2孔为以一组,每组加入鼠抗兔MHCI、MHCII单克隆抗体,4℃下作用12h,PBS洗3次10min,FITC标记羊抗鼠Igs,设立盐水对照组,流式细胞仪分析细胞MHC抗原表达情况。
结果:骨髓基质干细胞体外培养后贴壁、集落生长,细胞呈梭形、多角形,有多个大小不一的突起,胞浆淡蓝色,含有较大的颗粒,核卵圆形,细胞分裂相多见,连续传代培养生长良好。细胞生长曲线示细胞生长状态良好。培养2周后骨髓基质干细胞表面CD4抗原表达阳性。
骨髓基质干细胞向成骨方向诱导后骨钙蛋白表达阳性。
骨髓源性成骨细胞表面MHCII类抗原不表达、MHCI类抗原表达。
结论:骨髓基质干细胞容易获取、来源充足、可以大量扩增,加入诱导液后细胞形态发生改变并向成骨细胞分化,可作为骨组织工程的种子细胞。BMP-2重组蛋白是良好的成骨诱导剂,低浓度即可引起MSCs分化。骨髓基质干细胞分化为成骨细胞后,未见免疫排斥反应性,可用于指导同种异体或异种MSCs移植治疗骨缺损的临床研究。