论文部分内容阅读
目的:暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是由多种原因引起的大量肝细胞坏死而出现严重的肝功能障碍,病人短期内进展至肝性脑病的一种综合征。具有起病急、进展快、病死率高的特点,迄今仍无有效治疗措施。虽然近年来在暴发性肝衰竭的发病机制、临床诊断、治疗等方面的研究取得了较大进展,但其发病机制仍不甚明确。发病机制的研究是提高FHF的防治水平的关键。
目前研究认为,FHF发生大块肝细胞坏死的病理过程中,细胞凋亡起着重要的作用。细胞凋亡的发生受凋亡相关基因的调控。凋亡调控基因可分为诱导基因和抑制基因。正常情况下两者表达平衡,若因某些因素刺激使其失衡,则导致疾病发生。Survivin是目前已知的抗凋亡作用最强的凋亡抑制蛋白.C-myc是诱导细胞凋亡的重要因素。
核转录因子(nuclear factor of kappa B,NF-kB)是一种广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的转录因子,可启动许多与细胞凋亡调控有关的基因的转录,如凋亡蛋白酶(caspase)、Bcl-2蛋白家族、死亡受体、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)和某些原癌基因等。在肝脏炎症、纤维化、肝细胞凋亡与再生等病理生理过程中均伴有NF-kB的活化,是调控肝脏病理损害的重要转录因子。但是由于刺激NF-kB活化的因素不同,活化的靶基因不同,NF-kB在调控细胞凋亡方面也发挥着不同的作用,通过信号转导途径既可抑制肝细胞的凋亡亦可促进肝细胞的凋亡。但目前国内外研究多集中在肝脏肿瘤方面,对其在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡的作用研究较少,其机制尚不清楚。
为此,本研究采用免疫组织化学和Western blotting方法检测暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-kB、survivin和c-myc的表达情况,通过形态学和流式细胞学观察肝细胞凋亡情况,分析NF-kB活性与肝细胞凋亡程度、凋亡抑制蛋白survivin、原癌基因c-myc的关系,从细胞和蛋白水平探讨NF-kB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及作用机制。为临床如何应用NF-kB抑制剂治疗暴发性肝衰竭提供理论依据。
方法:
1.研究对象:雄性Wistar大鼠45只,清洁级,体重180~200g。将大鼠随机分为模型组30只,对照组15只。模型组腹腔注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)800mg/kg,之后皮内注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)10μg/kg,制造暴发性肝衰竭模型。对照组注射同样体积的生理盐水。
2.标本的采集和保存:分别于注药后2、4、8、12、24小时行股静脉放血处死,各时间点取模型组6只,对照组3只大鼠放血处死后立即剖腹取出肝脏,取适量肝组织分别经10%中性甲醛溶液、70%乙醇及4%戊二醛固定,部分经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。
3.光镜及电镜下观察肝组织病理学改变。
4.采用免疫组化S-P法,对肝组织标本进行NF-kBp65、survivin和c-myc的免疫组化染色。结果评估参照Fromowitz[9]的综合计分法进行。分别按染色细胞的分布和染色深度计分,最终结果用阴性、弱阳性、阳性、强阳性来表示。
5.Western blotting检测细胞核内NF-κB蛋白和总蛋白内survivin蛋白的表达。
6.流式细胞术进行细胞凋亡率定量检测和细胞周期分析。
7.统计学处理:应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,采用秩和检验和Spearman秩相关分析。P<0.01时有显著性差异。
结果:
1.一般状况观察:对照组大鼠一般状况较好,无死亡。模型组随着给药时间延长,大鼠依次出现活动减少、精神萎靡、毛发竖立、反应迟钝、嗜睡、昏迷。
2.肝组织形态学观察:(1)大体标本观察:对照组大鼠肝脏基本正常。模型组肝组织随着给药时间延长出现肿胀、充血、出血点、局部淤血、坏死,肝组织脆性增加。(2)HE染色:对照组肝组织基本正常。模型组肝组织随给药时间延长病理损害逐渐加重。光镜下可观察到肝细胞水肿、嗜酸性变,凋亡小体形成,炎性细胞浸润,肝组织出血,肝细胞大片坏死,肝小叶结构破坏。(3)电镜下观察:对照组大鼠肝细胞超微结构完整。模型组大鼠肝细胞明显肿胀,肝细胞核不规则,核膜向外呈锐角突起;核染色质高度浓缩,边集于核膜下;线粒体肿胀明显,脊变短并部分消失;粗面内质网扩张,并有脱颗粒现象。
3.肝组织NF-κB检测结果:(1)免疫组化方法:对照组主要为少量非实质细胞(肝窦内皮细胞和库普弗细胞)染色阳性,细胞浆弱表达,极少见细胞核内有阳性物质表达。模型组表达阳性细胞主要为肝细胞、库普弗细胞。2h组主要是肝细胞的胞浆着色,4h、8h、12h时核阳性表达的细胞数明显增多,明显高于对照组(P<0.01)。(2)Westernblotting 方法:对照组肝细胞胞核中有极少量NF-κBp65蛋白存在,各时间点表达无明显差别(P>0.05)。模型组2、4、8、12h细胞核内NF-kB含量逐渐增加(P<0.01)。
4.肝组织survivin检测结果:(1)免疫组化方法:对照组肝组织未检测到survivin蛋白表达。模型组survivin蛋白主要表达在肝细胞胞浆内。随着肝组织病变程度的加重,阳性细胞表达程度逐渐增加(P<0.01)。(2)Western blotting方法:对照组肝细胞中几乎无survivin蛋白表达。模型组随着肝组织病变程度的加重,survivin蛋白表达逐渐增高(P<0.01)。
5.免疫组化方法检测c-myc蛋白表达:对照组肝组织内未检测到c-myc蛋白表达。模型组c-myc蛋白主要表达在肝细胞胞浆内,随着肝组织病变程度加重,阳性细胞表达程度逐渐增加(P<0.01)。
6.流式细胞术检测结果:(1)细胞凋亡率:对照组肝细胞凋亡率较低,各时间点凋亡率无明显差别(P>0.05)。模型组2h、4h、8h、12h肝细胞凋亡率随着给药时间的延长,肝细胞凋亡率依次呈显著上升趋势(P<0.01)。(2)细胞周期变化:与对照组相比模型组的周期改变主要表现在G1期缩短(细胞比例减少)和S期延长(细胞比例增加)(P<0.05)。7.NF-kB与survivin、c-myc、细胞凋亡率的关系:NF-kB与survivin、c-myc、细胞凋亡率之间均呈正相关关系(r=0.820,P<0.01; r=0.827,P<0.01;r=0.613,P<0.01)。
结论:
1.应用D-GalN+LPS造模可反映暴发性肝衰竭发生的病理变化过程,并可动态观察暴发性肝衰竭肝脏组织病变演变过程,适于暴发性肝衰竭发病机制的研究。
2.从细胞和蛋白水平证实了NF-kB参与了暴发性肝衰竭的病理损伤。正常情况下肝脏非实质细胞浆有少量表达。暴发性肝衰竭时,肝细胞核中NF-kB表达随病情进展而增高,是导致暴发性肝衰竭的重要的因素。
3.从形态学、细胞学和凋亡相关基因方面证实肝细胞凋亡在暴发性肝衰竭病理过程中起着重要的作用。
4 从细胞和蛋白水平证实了NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中起着重要作用。在疾病进展的过程中,它既可以使抗凋亡基因survivin表达增加也可以使促凋亡基因c-myc表达增加。提示暴发性肝衰竭时肝细胞凋亡受多种因素调控,疾病进展的不同阶段肝细胞凋亡的发生机制不同,对疾病的影响不同。而NF-κB也不是唯一的调控通路。因此,试图通过抑制NF-κB活性,达到阻断暴发性肝衰竭的病理过程值得商榷。