番茄碱性/中性转化酶SlCIN7基因在果实发育中的功能研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:ciscohd
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植物通过转化酶将蔗糖分解为葡萄糖和果糖,来为植物提供生长发育的能源物质,以及作为与外界环境反应的信号因子,以此来调控植物的生长发育周期。转化酶分为酸性转化酶和碱性/中性转化酶(alkaline/neutral invertase,cytoplasmic invertases,CINs)。目前对于酸性转化酶的功能及其作用机制已有深入地研究,但CINs由于该家族蛋白的非糖基化特征造成其不稳定性,对其功能知之甚少。近来研究表明其在拟南芥、水稻等模式植物的器官发育和产品品质形成具有重要作用。但在以果实作为产品器官的园艺作物-番茄中的功能尚不清楚。本研究以Micro-Tom番茄为试材,对果实中表达量较高的SlCIN7基因进行转化酶活性、组织细胞定位及基因的沉默与过表达研究,对其功能进行了初步探究。主要研究结果如下:1)番茄SlCIN7开放阅读框长1996bp,它编码一个等电点为5.84,具有655个氨基酸残基的蛋白质,其分子量是73.51kDa。通过构建系统进化树发现SlCIN7被分类为α亚族,亚细胞定位预测表明其定位于线粒体中。2)构建pET30-SlCIN7原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,提取总蛋白进行体外酶活性分析,结果表明SlCIN7具有转化酶活性,可以在体外催化蔗糖分解,并且其最适酶活pH值为7.0。3)通过PCR扩增获得SlCIN7基因的启动子全长,利用Gateway技术构建了含SlCIN7启动子的GUS表达载体,转化农杆菌GV3101后,在番茄果实中进行了瞬时表达,结果表明SlCIN7主要在果肉、维管束和胶质胎座中有表达活性。进一步构建了SlCIN7-GFP融合的植物表达载体,在烟草叶肉细胞中进行了瞬时表达,结果表明SlCIN7蛋白定位于线粒体中。4)构建SlCIN7的RNA干扰载体及过表达载体,利用农杆菌介导转化番茄Micro-Tom,经选择标记的PCR鉴定及目的基因的表达分析,获得过表达株系50株,沉默植株40株。5)过表达SlCIN7基因的转基因株系表型与未转基因植株无明显变化。但沉默SlCIN7基因后,转基因番茄果实中没有种子。进一步对其花粉生活力检测结果发现花粉活力明显降低,活性氧染色结果表明转基因花粉粒中活性氧含量明显升高。以上结果表明SlCIN7基因具有转化酶活性,在番茄中沉默该基因影响果实发育并导致单性结实。这为进一步研究SlCIN7基因在番茄果实成熟过程中的功能奠定了基础。
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