马铃薯是全球第4大作物,也是我国大力推广的新型主粮,在我国国民经济中具有重要的地位。我国马铃薯总产量连续多年位居世界第一,但是平均产量较低,一部分原因是块茎无性繁殖虽然加速繁殖避免种质变异,但也造成病毒在块茎上的常年积累。其中,马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是一种严重影响我国马铃薯产业的病毒病害。虽然PVX单独侵染许多马铃薯品种不表现出明显症状,但是它与其他病毒复合侵染时可对马铃薯产量和品质造成严重影响。黑龙江省是我国马铃薯的主产区之一,对主栽品种进行抗病鉴定可为规划品种格局提高产量奠定基础。此外,对PVX抗性基因的挖掘和机制研究,可为马铃薯抗病育种奠定基础。本研究对克新13号、尤金、大西洋等23个东北地区主要栽培品种进行了 PVX抗病鉴定,并对抗病品种进行了抗病机理分析。发现的5个抗病品种中,4个品种携带Rx基因赋予其对PVX的极端抗性。此外,在外引1号中发现了全新的抗病途径,取得的主要结果如下:1.对东北地区马铃薯主要栽培品种的PVX抗性进行了鉴定:对23个脱毒处理的栽培品种组培苗,用农杆菌浸润法接种PVX。接种后12天通过DAS-ELISA与RT-PCR对系统叶进行检测。结果显示陇薯3号、尤金、大西洋、外引1号和外引2号5个品种对PVX具有抗性。对PVX侵染性克隆进行改造,获得带有黄色荧光蛋白(YFP)标记的PVX侵染性克隆(pGR107-YFP)。用pGR107-YFP对抗病品种进行再鉴定,结果表明陇薯3号、尤金、大西洋和外引2号对PVX侵染免疫,而外引1号显著推迟了 PVX的发病时间,说明外引1号与其它4个抗病品种具有不一样的抗性。2.对抗病品种的Rx基因进行了鉴定:根据Rx基因的保守核苷酸序列设计引物,对5个抗病品种进行RT-PCR鉴定。陇薯3号、尤金、大西洋、外引2号能扩到特异条带,而外引1号扩增不到对应大小条带。对扩增片段进行基因克隆及测序,结果显示4个品种中均含有Rx基因。其中大西洋与陇薯3号核苷酸序列与Rx1完全一致。而尤金与外引2号为Rx的同系物。实验结果说明陇薯3号、尤金、大西洋、外引2号抗病途径为Rx抗病基因赋予马铃薯的极端抗性,而外引1号抗病途径未知。3.对外引1号的抗病机制进行了初步的分析:用摩擦接种将pGR107-YFP分别接种克新1号与外引1号,荧光观察发现PVX 10天后系统侵染克新1号,而外引1号需要14天以上。采用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)对接种叶中PVX基因组积累量进行检测,发现接种后48-96 h克新1号中PVX基因组积累量快速升高,而在外引1号中增速缓慢,说明外引1号可能抑制了 PVX复制或运动。单细胞荧光分析发现,在相同侵染时间时,外引1号的荧光量远较克新1号弱,说明外引1号可能抑制了 PVX的复制。用构建的运动缺陷型并带有荧光标记的PVX侵染性克隆(pGR107-TGBp2△52-60-YFP)摩擦接种外引1号和克新1号,再通过qRT-PCR对PVX基因组积累量进行检测,结果显示PVX基因组在外引1号中的增长速度慢于在克新1号,表明PVX的复制在外引1号中受到抑制。此外,qRT-PCR还发现,PVX侵染后,PR基因在外引1号中表达水平高于在克新1号,说明外引1号接种PVX后抗免疫反应被激活。