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目的:证实LL-37/CRAMP是否影响NTHi-DNA诱导的IFN-β表达,并了解其对NTHi感染所致COPD模型小鼠肺部炎性损伤效应。背景:慢性阻塞性肺疾病(COPD)是中国继高血压和糖尿病之后的第三大常见慢性病。不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)感染是导致COPD急性加重(AECOPD)的主要原因之一。对NTHi和宿主相互作用的免疫应答进行深入的研究,可为预防及治疗NTHi感染诱发的COPD急性加重提供新的理论基础。我们前期研究发现NTHi-DNA通过促进IFN-β分泌而加剧炎症反应,不利于COPD的疾病转归,但是否存在某种分子可以调控NTHi-DNA介导的免疫应答反应,从而影响COPD疾病感染的转归,目前尚不清楚。在对临床样本检测中发现,一种抗菌肽,LL-37的表达水平与COPD疾病进程密切相关。LL-37是人体内唯一的cathelicidin家族抗菌肽,在机体免疫应答反应中起着不可或缺的作用,Cathelicidin-related antimicrobial peptide(CRAMP)则是其在小鼠中的唯一同系物。我们在体外实验的初步研究中也观察到,当RAW264.7细胞受到NTHi-DNA刺激时,LL-37/CRAMP的表达水平将随之上调。这提示该抗菌肽可能参与NTHi-DNA诱导的免疫反应,并在COPD发生发展过程中扮演一个重要的角色。因此我们将对NTHiDNA与宿主分泌的抗菌肽LL-37/CRAMP之间的关系进行探讨,并解析其在COPD疾病模型中相互作用的机制。主要研究方法:1.体外实验以NTHi-DNA或NTHi全菌处理RAW264.7细胞后,real-time PCR和IHC检测LL-37/CRAMP的表达水平。同时,用LL-37/CRAMP预处理RAW264.7细胞,检测巨噬细胞对NTHi的吞噬杀伤能力是否受抗菌肽调控,初步探究LL-37/CRAMP在巨噬细胞抵御NTHi侵袭中的作用。2.NTHi-DNA或NTHi全菌刺激RAW264.7细胞,随后外源性给予LL-37/CRAMP,通过real-time PCR和ELISA进行检测IFN-β、IL-1β、IL-6、ISG15及NOS2等相关因子变化情况,验证LL-37/CRAMP对NTHi-DNA介导的免疫反应的调控效应。3.NTHi-DNA或NTHi全菌刺激RAW264.7细胞,随后外源性给予LL-37/CRAMP,WB检测STING及p38 MAPK等相关信号通路的变化情况。进一步用NTHi-DNA或NTHi全菌刺激野生或STING缺陷的MEF细胞,WB检测p38 MAPK通路的表达变化情况,探讨LL-37/CRAMP可能通过何种信号机制调控NTHi-DNA介导的免疫应答反应。4.以LPS刺激建立COPD模型小鼠,随后COPD小鼠滴鼻感染NTHi,同时LL-37/CRAMP经呼吸道给药,在体内通过real-time PCR验证小鼠肺组织匀浆IFN-β、IL-1β、IL-6及ISG15等细胞因子变化情况;real-time PCR检测小鼠肺组织匀浆MMP-9及ICAM-1的表达水平,监测小鼠体重,H&E染色观察小鼠肺部炎性损伤情况,验证LL-37/CRAMP对NTHi感染的COPD小鼠疾病转归的影响。主要研究结果:1.NTHi-DNA或NTHi刺激能上调RAW264.7巨噬细胞中LL-37/CRAMP的表达;外源性给予LL-37/CRAMP虽不影响RAW264.7细胞对NTHi的吞噬作用,但其能显著促进巨噬细胞对细菌的杀伤作用。2.体外实验结果发现,LL-37/CRAMP降低RAW264.7细胞中NTHi-DNA或者NTHi诱导的IFN-β、炎性因子IL-1β、IL-6和ISG15、及巨噬细胞促炎标志物NOS2的表达;LL-37/CRAMP对NTHi-DNA介导的免疫反应的调控效应可能与其对STING/p38 MAPK信号通路的抑制作用相关。3.在NTHi感染的COPD小鼠体内,LL-37/CRAMP同样具有抑制IFN-β及炎性因子IL-1β、IL-6和ISG15表达的作用;LL-37/CRAMP还可部分恢复NTHi感染所致的COPD小鼠体重丢失并减轻肺部炎性损伤。结论:本研究证实LL-37/CRAMP可抑制NTHi-DNA介导的IFN-β和相关炎性细胞因子过度表达,而减轻NTHi感染引起的COPD小鼠肺部炎性损伤。LL-37/CRAMP对NTHi-DNA诱导的免疫应答调节作用与STING/p38 MAPK信号通路相关。本研究阐明了NTHi-DNA免疫刺激与巨噬细胞LL-37/CRAMP上调的关系,揭示了细胞抗菌肽分泌在COPD疾病中对抗细菌感染的调控作用,为防治NTHi感染的COPD加重提供了新的理论基础和思路。