前言：虽然医学不断发展和进步，但中枢神经系统(CNS)由于存在神经元不可再生性和血脑屏障等特殊性，CNS疾病的治疗方法却鲜有突破，基因治疗作为目前生命科学研究热点，已在多个领域疾病的治疗中获得重大进展，也为CNS疾病的治疗提供了新思路和方法。　　 慢病毒作为一种逆转录病毒，可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上，并且能够感染非分裂细胞，成为当前CNS基因治疗研究的热点领域。马传染性贫血病毒(Equine Infectius Anemia Virus，EIAV)是一种非灵长类慢病毒，而且是基因组结构最简单的慢病毒，具有慢病毒的特性，但对人类没有致病性，用于开发慢病毒转基因载体更具有生物安全性。本研究的目的在于利用我国在马传染性贫血病毒(EIAV)研究上的成果，在EIAVFDDV(驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株)的基础上，构建EIAV三质粒转基因载体系统，为CNS疾病的基因治疗提供一个新的研究手段。　　 实验一：EIAV载体构建模板序列比较分析。目的：基因组高度变异和抗原漂移是包括HIV在内的所有慢病毒的共同特点。为深入理解EIAV的各基因功能，并为建立三质粒载体系统建立理论基础，我们的研究首先分析了构建所需的模板；方法：对EIAVFDDV13和其亲本强毒株辽宁毒株(EIAVLN40)的前病毒基因组序列进行了分析，并与国际主要毒株进行了比较；结果显示中国EIAV与美洲和日本主要毒株遗传距离较远，处于单独的分支，全基因组差异高达23％左右。其中，LTR的差异率在14％以上，各开放阅读框架的差异率都在20％以上，gp90核苷酸差异率在35％左右，氨基酸的差异率是40％。结论：经过长期的体外传代，EIAVFDDV13在各个基因积累了多处稳定的替换突变，主要包括：1）EIAVFDDV13的LTR (LTRFDDV13)在负调节区出现11bp的重复序列的插入，新出现了转录因子AP.1结合位点和E_box结合基序，导致体外转录活性显著升高；2）gp90的编码蛋白在氨基酸序列上存在较高变异，主要诱导中和抗体的V3区和V4区分别丢失了一个糖基化位点，但与立体构象密切相关的半胱氨酸残基和糖基化位点则高度保守；3）env在2130为碱基发生G→A的突变，使得gp45截短表达。以上疫苗株的多基因多位点突变，特别是保守性突变的特性，为指导EIAV载体系统的实验设计至关重要，在理论基础上保证了构建这一载体系统成功的可行性。　　 实验二：三质粒载体的构建和表达。目的：构建适用于中枢神经系统的EIAV转基因载体系统。方法：在实验一的研究基础上，利用反向遗传操作技术，以EIAVFDDV克隆为基础，构建了复制缺陷性EIAV载体质粒pLCEL;同时将EIAV基因片段插入真核表达载体中构建了囊膜缺失的EIAV gag/pol包装质粒pc-GP2:以水泡性口炎病毒囊膜糖蛋白（VSV-G）基因构建的提供囊膜伪型的VSV-G的真核表达载体质粒pCIVG提供囊膜蛋白，建立EIAV三质粒转基因载体系统。为提高包装效率，将囊膜缺失的EIAV gag/pol包装质粒pc-GP2转入293T细胞构建成持续表达GAG/POL蛋白的EIAV-GP细胞系。结果：我们成功构建了EIAV三质粒转基因载体系统，并成功构建EIAV-GP细胞系，成功的包装出囊膜微型化EIAV病毒，携带报告基因EGFP在人类293T细胞和大鼠神经元细胞内表达。结论：我们在中国EIAVFDDV的基础上，成功构建EIAV三质粒转基因载体系统，证明可以在神经元细胞内表达。