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血管钙化是心脑血管疾病如冠状动脉粥样硬化、高血压、脑卒中、血管损伤、慢性肾衰竭、糖尿病等疾病普遍的、共同的病理表现。研究已明确,血管平滑肌细胞、间充质干细胞、周细胞等在高脂、高糖、炎症、氧化应激、机械损伤等危险因素的作用下,均可以发生钙磷沉积,表达成骨样表型,参与血管钙化的发生和发展。来源于骨髓的内皮祖细胞(EPCs)由于其具有的干细胞特性,在危险因素作用下,也可能表达钙化表型,加剧血管损伤的进程。
基于以上分析,本研究以内皮祖细胞为研究对象,探讨缺血性脑血管病患者循环内皮祖细胞是否高表达成骨分化标志物骨钙素(OCN),以确定其体内参与血管钙化的可能性;再通过体外培养大鼠骨髓来源的内皮祖细胞,验证其在危险因素氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)干预下的成骨分化能力:并简要探讨氧化应激信号通路是否参与此成骨分化过程,以提示表达特异性骨相关蛋白骨钙素的内皮祖细胞可能成为血管钙化的循环细胞学标志物,为阐明新一类干细胞参与血管钙化及细胞靶向治疗提供新思路。
1、缺血性脑血管病患者循环内皮祖细胞异位表达骨钙素
目的:检测缺血性脑血管病患者循环内皮祖细胞表达骨钙素的绝对数量和相对比例,确定其在体成骨分化能力,为评价血管钙化探索细胞学标志物。
方法:采用病例对照研究方法,比较病例组(n=51)和对照组(n=30)缺血性脑血管病传统危险因素的差异;应用流式细胞仪检测外周血EPCs标志性表面分子及骨钙素表达比例,分析其与血管钙化和血管狭窄的相关性,并建立logistic回归方程评价OCN阳性EPCs百分比对缺血性脑血管病的预测能力。
结果:病例组EPCs数目、OCN阳性的EPCs数目以及其百分比均显著高于对照组(均P＜0.01)。OCN阳性的EPCs百分比ROC曲线下面积为0.812。病例组中,钙化组OCN阳性的EPCs百分比高于非钙化组(P=0.033),ROC曲线下面积为0.697。而不同程度的脑血管狭窄组之间,OCN阳性的EPCs百分比差异无统计学意义(P=0.672)。OCN阳性的EPCs百分比是缺血性脑血管病发病的独立危险因素(优势比为1.143,95%可信区间为1.060～1.232)。
结论:缺血性脑血管病患者循环EPCs表达OCN上调,与血管钙化的病理状态具有一致性。OCN阳性的EPCs可作为评价缺血性脑血管钙化的细胞学指标。
2、大鼠骨髓内皮祖细胞分离培养鉴定
目的:鉴于人体外周血内皮祖细胞来源于骨髓,且外周血取材受限,数量较少,本部分分离培养鉴定大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(BMEPCs)作为体外研究定向分化的干细胞模型,为确定内皮祖细胞成骨分化能力提供工具。
方法:分离大鼠骨髓,Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞,经特定的培养液筛选培养后,流式细胞仪和荧光染色方法进行鉴定。
结果:骨髓来源的单个核细胞在内皮系统选择性培养液中培养7天后,出现典型的纺锤状形态特征,可摄取DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1,双阳细胞约占细胞总数的78.3%±4.2%;细胞表面分子CD133的阳性率为23.5%±4.0%,CD34为46.2%±5.8%,KDR为74.3%±8.8%。
结论:此方法建立的培养体系具备内皮祖细胞的特征,可用于体外诱导分化的研究。
3、体外骨髓内皮祖细胞成骨分化能力及其可能机制
目的:通过检测细胞内钙沉积、成骨基因及蛋白表达等指标,体外验证骨髓内皮祖细胞在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)干预下成骨分化的能力,探讨氧化应激信号通路是否参与此成骨分化过程,为内皮祖细胞参与血管钙化提供直接证据。
方法:实验分为对照组、Ox-LDL组、β-GP组、二者联合组。Ox-LDL和(或)磷酸甘油(β-GP)诱导内皮祖细胞,生化法检测钙定量,VonKossa方法检测细胞内钙沉积,RT-PCR方法检测相关基因的表达,光度法检测ALP活性及细胞免疫荧光染色检测OCN的表达。流式细胞仪检测细胞内ROS。
结果:(1)在不同浓度ox-LDL作用下,BMEPCs存活率呈时间剂量依赖性。在作用后14d,5μg/ml组的BMEPCs存活率约93%,与对照组无显著差异。为保证钙化诱导过程中的细胞活性,本实验选择5μg/ml为诱导钙化的浓度。
(2)β-GP是体外作为高磷供体参与细胞钙化,常规作为阳性对照组。BMEPCs经5μg/mlox-LDL和(或)10mmol/Lβ-GP诱导14d后,定量分析结果显示,对照组细胞钙含量为4.4±0.95μg/mg蛋白,单纯ox-LDL组和β-GP作用组,钙沉积均增加,分别为12.3±3.2μg/mg蛋白和17.2±2.0μg/mg蛋白。当二者联合使用时,细胞内钙含量为28.0±2.4μg/mg蛋白。钙沉积染色显示细胞内钙颗粒沉积比对照组显著增多。定量和定性结果一致性良好。
(3)BMEPCs诱导7d后,ox-LDL联合β-GP作用,可使cbfa-1的表达增高2.2倍。Ox-LDL单独作用可使OPG降低约50%。诱导至10d,ox-LDL和β-GP均可上调OCN的表达,二者协同作用,OCN表达可增加2.8倍(均P＜0.05)。
(4)诱导11d后,Ox-LDL和β-GP均可增加ALP活性(P＜0.05)。
(5)细胞免疫荧光染色诱导14d后的BMEPCs中OCN阳性细胞数量在各组之间无显著差异。
(6)ROS数据以第1d正常对照组的百分比表示。第1,3,5d,细胞内ROS水平显著增加。Ox-LDL组,ROS水平分别为对照组的382%±20%,276%±19%和244%±31%。第5d比第1dROS产生有所改善。
(7)正常情况下,HIF-1α几乎不表达,经ox-LDL作用第7d,HIF-1α增加5倍以上。
结论:骨髓来源的内皮祖细胞体外在危险因素作用下具有一定的成骨分化的能力,包括成骨基因及表型的改变。Ox-LDL诱导BMEPCs分化过程中,转录因子ROS和HIF-1α相继激活,氧化应激信号途径参与此过程。
综上所述,在体内多种危险因素综合作用下以及体外较为单一的氧化诱导环境下,内皮祖细胞均可分化为成骨细胞样表型和功能,确定了内皮祖细胞在血管钙化的发生发展中的作用,也期待表达成骨分化分子骨钙素的内皮祖细胞可作为循环细胞标志物对血管钙化的评价发挥作用。更重要的是I临床开展循环内皮祖细胞检测具有很好的可行性,应用前景广阔。