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β-葡萄糖醛酸苷酶可以水解甘草酸(glycyrrhizin,GL)的葡萄糖醛酸苷键生成附加值更高的衍生物单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetic acid3-O-mono-β-D-glucuronide,GAMG)或甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA),产物相较于GL除了有更多的药理活性外也是良好的甜味剂,因此具有重大生产意义。但在工业环境下,利用生物法温和地生产GAMG或GA需要β-葡萄糖醛酸苷酶具有良好的耐热性和耐碱性。目前,实验室改造β-葡萄糖醛酸苷酶只是单方面提高耐碱性或耐热性,对底物GL转化生产GAMG或GA的效率提升仍然有限。因此,本课题将酶的耐热性和耐碱性结合起来,针对两个来源不同的β-葡萄糖醛酸苷酶(来源于嗜松篮状菌的TpGUS79A和来源于米曲霉的PGUS),通过分析酶分子的序列与结构信息,定向改造氨基酸,最终获得了耐热性和耐碱性同时提高的突变体。主要工作如下:1.首先,利用在线预测软件hotspots wizard 3.0分析了TpGUS79A-P-6Ps(TpGUS79A-P的基础上,并构入了6对二硫键提高其耐热性的工程β-葡萄糖醛酸苷酶)的序列信息,结合PyMOL对酶模拟结构的分析,选取了可能提高稳定性的8个氨基酸:E118、E155、E182、D230、D273、D382、E409、D502作为候选(其中6个位于表面长的无规卷曲上,两个位于活性中心附近),将其突变成了精氨酸,以期在β-葡萄糖醛酸苷酶耐热的基础上提高其耐碱性。2.其次对突变后的TpGUS79A-P-6Ps在不同温度和pH下的活性进行了测试,结果显示构建的突变体均表现得无活性,而且突变体WT和出发酶TpGUS79A-P-6Ps的活性也表现得较低。从理论分析原因可能是突变引起了二级结构的改变,挤压了通道,底物不能正常进入酶活性中心所致。除此之外通过重新活化以补糖发酵提高了酶产量。3.利用VMD软件对耐碱和耐热组合后的突变体进行同源建模,并通过分子动力学模拟了耐碱突变体(截除PGUSE的C末端14个氨基酸)、耐热突变体(突变PGUSE表面9个酸性氨基酸为精氨酸)和双策略组合突变体(耐热耐碱策略组合)这三个工程酶突变后对酶稳定性的影响。通过模拟后的参数RNSD和RMSF可以看出组合后酶的稳定性有一定的提升。4.基于分子动力学模拟的预测结果,我们构建了6个可能提高耐热耐碱性的突变体PGUSE-D591-604-E79R、PGUSE-D591-604-E124R、PGUSE-D591-604-E135R、PGUSE-D591-604-E150R、PGUSE-D591-604-D200R和PGUSE-D591-604-5Rs。通过实验验证发现,突变体的仍然在40℃表现出最大活性,而最适pH从4.5移到了6.5,提升了2个单位。耐热性和耐碱性方面,双重策略组合突变体PGUSE-D591-604-5Rs表现最佳,在65℃下热处理120min,仍能保持高于野生型30%的活性,而在pH 7.5下处理5 h,仍有高于野生型12%的活性残余。