论文部分内容阅读
研究目的(1)检测RhoC和IQGAP1 (IQ-domain GTPase-activating protein1)在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达,分析RhoC和IQGAP1的相关性以及两者与临床病理参数的相关性。(2)研究RhoC和IQGAP1在调控胃癌细胞迁移、增殖过程中的作用以及在调控过程中两者之间的相互关系。研究方法(1)分别将构建的编码IQGAP1和IQGAP1-C基因的腺病毒载体以及获赠的编码结构活性型RhoC基因的腺病毒载体转染293A细胞,制备病毒,并对病毒滴定以及感染后目的蛋白的表达进行检测,选择对重组腺病毒敏感的胃癌细胞株进行后续实验。(2)采用RT-PCR、Western blotting、免疫荧光等方法,检测IQGAP1和RhoC在胃癌组织和细胞株中的表达；利用Spearman’s rank相关性分析分析胃癌组织中RhoC与IQGAP1表达的相关性；利用Fisher确切概率法,分析两者的表达与临床病理参数相关性。(3)通过感染腺病毒pAd-RhoC-V14,增加细胞内结构活性型RhoC的表达,采用MTT实验分析RhoC对胃癌细胞增殖的影响；采用transwell迁移实验分析RhoC对胃癌细胞迁移的影响。(4)将质粒Flag-IQGAP1、Flag-IQGAP1-C或Flag-IQGAP1-N(分别编码IQGAP1全长、C末端或N末端)与绿色荧光蛋白(GFP)质粒共同转染胃癌细胞BGC-823,采用BrdU掺入实验分析不同结构的IQGAP1对单细胞增殖的影响。(5)通过感染编码IQGAP1(编码IQGAP1全长)或IQGAP1-C(编码IQGAP1的C末端,氨基酸：860-1657)基因的腺病毒,增加胃癌细胞内IQGAP1或IQGAP1-C的表达,采用MTT实验分析IQGAP1或IQGAP1-C在胃癌细胞增殖中的作用；采用trans well迁移实验分析IQGAP1或IQGAP1-C在胃癌细胞迁移过程中的作用。(6)通过转染RhoC-siRNA和IQGAP1-siRNA,分别干扰胃癌细胞中RhoC和IQGAP1蛋白的表达；采用MTT实验和transwell迁移实验,分别观察抑制RhoC或IQGAP1表达对胃癌细胞增殖和迁移的影响。(7)采用Western blotting对细胞粘附、迁移相关蛋白ICAM-1、vimentin、MMP-2等进行检测,进而分析RhoC和IQGAP1对上述蛋白表达的影响。(8)利用RhoC-siRNA干扰胃癌细胞内RhoC的表达,然后再将编码IQGAP1和IQGAP1-C基因的腺病毒感染胃癌细胞,通过transwell迁移实验和MTT实验分析干扰RhoC的表达是否影响IQGAP1刺激的胃癌细胞迁移和增殖；利用IQGAP1-siRNA干扰胃癌细胞内IQGAP1的表达,再将编码结构活性型RhoC基因的腺病毒感染胃癌细胞,通过transwell迁移实验和MTT实验分析干扰IQGAP1的表达是否影响RhoC刺激的胃癌细胞迁移和增殖。(9)分别将腺病毒pAd-IQGAP1或者pAd-IQGAP1-C与pAd-RhoC-V14共同感染非洲绿猴SV40转化的肾细胞COS-7和胃癌细胞BGC-823,通过免疫荧光和免疫共沉淀方法,观察RhoC与IQGAP1在细胞中的定位和结合情况。研究结果(1)在29例胃癌组织标本中,RhoC和IQGAP1的表达高于对应癌旁组织者有22例,占总例数的75.9%(22/29)；IQGAP1和RhoC在胃癌组织中的表达水平均与肿瘤分化程度负相关(P<0.05,P<0.05),与胃癌细胞的迁移、增殖、浸润有一定的相关性,但是差异没有统计学意义。(2)利用制备的重组腺病毒pAd-IQGAP1、pAd-IQGAP1-C和pAd-RhoC-V14感染胃癌细胞；Western blotting结果显示,在感染上述腺病毒的胃癌细胞中IQGAP1、IQGAP1-C和RhoC蛋白的表达明显增加；在后续试验中,选取增殖能力较强的BGC-823细胞和迁移能力较强的AGS细胞分别做增殖和迁移分析。(3)RhoC和IQGAP1在三种胃癌细胞株中的表达明显高于胃粘膜上皮细胞株GES-1；IQGAP1在胃癌细胞内的分布以在细胞膜和细胞与细胞粘连处居多。(4)结构活性型RhoC能明显促进胃癌细胞的迁移和增殖,干扰RhoC的表达抑制了胃癌细胞迁移和增殖。(5)IQGAP1和IQGAP1-C明显增强胃癌细胞迁移和增殖能力,而IQGAP1-N对胃癌细胞增殖的影响不明显。IQGAP1-siRNA可以显著抑制细胞迁移和增殖。(6)结构活性型RhoC和IQGAP1可以明显促进胃癌细胞vimentin和MMP-2的表达,抑制ICAM-1表达。(7)干扰RhoC的表达对IQGAP1刺激的胃癌细胞迁移和增殖没有明显影响；而干扰IQGAP1的表达明显抑制了RhoC刺激的胃癌细胞迁移和增殖。(8)免疫共沉淀和免疫荧光结果显示,RhoC与IQGAP1蛋白直接结合。结论RhoC和IQGAP1在胃癌组织中表达增加,两者的表达密切相关,并且与肿瘤的分化程度呈负相关。IQGAP1、IQGAP1-C以及结构活性型RhoC对胃癌细胞的迁移和增殖有促进作用。RhoC直接与IQGAP1的C末端结合,并将IQGAP1作为下游效应蛋白,调控胃癌的细胞迁移和增殖。