文章主要分为以下几部分：　　 第一章:天然化合物DC250188对骨骼肌中糖脂代谢及相关信号通路的调控研究　　 目的:以骨骼肌为靶组织,研究天然化合物DC250188对糖脂代谢相关功能及相关信号通路尤其是胰岛素和AMPK信号传导通路的调控作用,初步阐明DC250188抗糖尿病作用的分子机理,为该化合物及其衍生物的进一步研究开发提供理论基础。　　 实验方案:　　 利用2型糖尿病ob/ob小鼠、离体孵育小鼠肌肉条、大鼠L6骨骼肌细胞和原代培养人骨骼肌细胞,在整体、组织及细胞水平上开展系统的研究。具体内容如下:　　 在整体水平上,观察DC250188长期给药后对ob/ob小鼠骨骼肌葡萄糖摄取、甘油三酯含量、胰岛素和AMPK信号通路中关键蛋白磷酸化的影响。　　 在组织水平上,观察DC250188对离体孵育的C57小鼠肌肉条葡萄糖摄取、游离脂肪酸氧化及胰岛素和AMPK信号通路关键蛋白磷酸化的影响。　　 在细胞水平上,观察DC250188对L6细胞葡萄糖摄取、游离脂肪酸氧化及胰岛素和AMPK信号通路关键蛋白磷酸化的影响。同时,应用抑制剂和RNA干扰方法,观察DC250188对骨骼肌细胞糖脂代谢调节的功能与相关信号通路的关系。此外,观察DC250188对原代培养人骨骼肌细胞糖脂代谢及相关信号通路的影响,为该化合物的临床有效性提供支持。　　 测定方法:　　 1.葡萄糖摄取测定:利用3H标记的2-脱氧葡萄糖孵育特定时间后,检测进入细胞或组织的同位素的量。2.甘油三酯含量测定:比色法测定。3.游离脂肪酸氧化测定:利用3H标记的棕榈酸孵育特定时间后,检测释放到培养基中3H标记水的量。4.蛋白磷酸化的检测:免疫沉淀和免疫印迹分析。5.AMPK激酶活性测定:利用32p标记的.ATP及AMPK底物肽链与AMPK蛋白孵育一定时间后,检测掺入AMPK底物肽链中32p的量。　　 结果:　　 1.在整体水平上,DC250188连续给药2到3周后,ob/ob小鼠比目鱼肌基础水平和胰岛素刺激的葡萄糖摄取有增加的趋势,腓肠肌甘油三酯含量有降低的趋势,腓肠肌中Akt、AMPK和ACC蛋白磷酸化水平均明显升高。　　 2.在组织水平上,C57小鼠肌肉条经DC250188离体孵育2h后,比目鱼肌中游离脂肪酸氧化和基础水平葡萄糖摄取明显增加,Akt、AMPK和ACC蛋白磷酸化均呈现上升趋势。　　 3.在离体培养大鼠L6细胞中,DC250188显著增加基础水平葡萄糖摄取,并呈明显的量效和时效关系,该作用不能被PI3Kinase抑制剂LY294002所完全抑制,但可被AMPK抑制剂Compound C所完全抑制。DC250188可显著增加L6细胞游离脂肪酸的氧化,且该作用可被Compound C完全抑制。DC250188可显著增加L6细胞中Akt、AMPK和ACC蛋白的磷酸化水平,并可增加IRS-1和IR蛋白酪氨酸磷酸化,但对mTOR蛋白磷酸化无影响。　　 4.在原代培养人骨骼肌细胞中,DC250188显著增加基础水平葡萄糖摄取和糖原合成,高剂量DC250188对胰岛素诱导的葡萄糖摄取和糖原合成也有促进作用。此外,DC250188还可促进细胞游离脂肪酸氧化,并增加细胞中Akt、AMPK和ACC蛋白磷酸化水平,并增加AMPK的激酶活性。　　 结论:　　 天然化合物DC250188可显著增加骨骼肌组织或离体培养骨骼肌细胞的葡萄糖摄取和游离脂肪酸的氧化,增加骨骼肌组织的胰岛素敏感性,该作用可能是DC250188对胰岛素和AMPK信号转导通路共同作用的结果。　　 第二章:AICAR对大鼠骨骼肌L6细胞中胰岛素信号通路的作用。　　 目的:研究ACIAR所诱导的L6骨骼肌细胞基础水平葡萄糖摄取的增加是否仅依赖于其对AMPK的激活,还是与胰岛素信号通路有关。同时研究AICAR是否增加Akt蛋白的磷酸化及其调控机制。　　 实验方案:　　 采用3H标记的2-脱氧葡萄糖观察ACIAR对大鼠L6骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响以及PI3Kinase抑制剂Wortmanin和AMPK抑制剂Compound C的调控作用。采用免疫印迹分析观察AICAR对L6细胞Akt蛋白磷酸化的作用以及Wortmanin和Compound C的调控作用。采用RNA干扰技术研究AMPK在AICAR所诱导的,Akt蛋白磷酸化增加中的作用。采用免疫沉淀技术观察AICAR对L6细胞IRS-1和IR蛋白酪氨酸磷酸化的影响。　　 实验结果:　　 AICAR显著增加L6细胞基础水平葡萄糖摄取,并呈明显的量效关系。单独使用Compound C或Wortmanin均不能完全抑制AICAR诱导的基础水平葡萄糖摄取的增加,但当两者合用时,AICAR对基础水平葡萄糖摄取的促进作用则被完全阻遏。AICAR可剂量和时间依赖性的增加L6细胞中Akt蛋白的磷酸化,Compound C和AMPK RNA干扰均不能抑制AICAR所诱导的Akt蛋白的磷酸化。AICAR剂量依赖地增加IRSl蛋白的酪氨酸磷酸化,但对IR蛋白的酪氨酸磷酸化无明显影响。AICAR还可显著增加L6细胞中mTOR蛋白的磷酸化。　　 结论:　　 本研究首次观察到AICAR可增加大鼠L6骨骼肌细胞Akt蛋白的磷酸化,而AICAR增加骨骼肌细胞葡萄糖摄取的功能并非完全依赖于其对AMPK的激活,胰岛素信号转导通路可能也参与该过程。