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第一部分:蛋白激酶CK2在肺癌中的表达以其与临床预后的关系目的:探究蛋白激酶CK2在肺癌细胞和组织中的表达情况,以及与肺癌患者预后的关系。方法:(1)Genecard网站检索(2)Western blot法检测CK2α、α’和β亚基蛋白在肺癌细胞中的表达情况。(3)TCGA数据库检索CK2各亚基基因(4)免疫组化法检测CK2各亚基蛋白在肺癌组织与癌旁组织中的表达情况。(5)Kaplan-Meier Plotter网站检索CK2各亚基基因表达与肺癌患者预后的关系。(6)免疫组化法检测CK2α蛋白表达,分析其与肺腺癌患者预后的关系。结果:(1)CK2各亚基蛋白在A549和H460细胞中均高表达。(2)CK2各亚基蛋白在肺癌细胞中均表达且高于在人脐静脉内皮细胞中的表达。(3)CK2各亚基基因在肺癌组织中的表达均高于癌旁组织。(4)CK2各亚基蛋白在不同病理类型肺癌组织中均表达,且表达高于癌旁组织。(5)CK2α和β亚基基因高表达的肺癌患者均预后不良。(6)CK2α蛋白表达高的肺腺癌患者预后差。结论:蛋白激酶CK2在肺癌细胞和组织中均表达,且在肺癌组织中表达高于癌旁组织,并与肺癌患者预后负相关。第二部分:放射对非小细胞肺癌细胞中蛋白激酶CK2亚定位及激酶活性的影响目的:探究X线照射在非小细胞肺癌中对CK2蛋白在细胞内亚定位以及CK2激酶活性的影响。方法:1、免疫荧光染色检测A549和H460细胞接受X线照射后CK2各亚基在细胞中亚定位的变化。2、Western blot法检测细胞接受X线照射后CK2各亚基在细胞核及细胞质表达量的变化。3、激酶活性实验检测X线照射后CK2激酶活性的变化。结果:1、A549和H460细胞X线照射后1h CK2各亚基在细胞核内表达增多,持续至6h以上。2、Western blot法检测A549和H460细胞X线照射后CK2各亚基在细胞核内蛋白表达增多。3、激酶活性实验检测A549和H460细胞在X线照射后6h激酶活性增高。结论:X线照射后蛋白激酶CK2在细胞核内表达增高,激酶活性增高,提示CK2可能参与了X线照射后细胞内生物过程的调控。第三部分:抑制蛋白激酶CK2活性对非小细胞肺癌放射敏感性的影响目的:探究抑制蛋白激酶CK2活性对非小细胞肺癌放射敏感性的影响及其机制。方法:1、激酶活性实验检测25μM CK2抑制剂醌茜素处理A549和H460细胞6h或24h后CK2激酶活性的变化。2、CCK8法检测12.5μM、25μM或50μM醌茜素处理24h、48h或72h后对细胞活力的影响。3、克隆形成实验检测12.5μM、25μM、50μM醌茜素或si-CK2α作用后对细胞放射敏感性的影响。4、流式细胞实验检测25μM醌茜素与4Gy X线照射联合作用对细胞凋亡以及细胞周期的影响。5、Ed U染色检测25μM醌茜素与4Gy X线照射联合作用对细胞DNA复制的影响。6、免疫荧光染色检测25μM醌茜素或si-CK2α作用与4Gy X线照射联合作用对细胞γ-H2AX和53BP1焦点形成的影响。7、建立裸鼠移植瘤模型,观察醌茜素与X线照射联合作用对移植瘤生长的影响。结果:1、25μM醌茜素处理A549和H460细胞6h或24h后均可有效抑制CK2的激酶活性。2、醌茜素处理可有效抑制A549和H460细胞活力。3、醌茜素与si-CK2α处理均可降低A549和H460细胞放射后存活分数,增强细胞放射敏感性。4、醌茜素与X线照射联合作用与醌茜素单独处理相比未能进一步增加A549和H460细胞凋亡但与两者单独处理相比均可明显增加G2/M期阻滞。5、醌茜素与X线照射联合作用与两者单独处理相比均可明显抑制A549和H460细胞DNA复制。6、醌茜素或转染si-CK2α处理均可增加A549和H460细胞X线照射后各时间点γ-H2AX焦点数,减少53BP1焦点数。7、醌茜素与X线照射联合作用与两者单独处理相比可进一步抑制H460细胞裸鼠移植瘤的生长。结论:抑制蛋白激酶CK2活性可增强非小细胞肺癌放射敏感性。第四部分:抑制蛋白激酶CK2活性通过抑制IL-6/JAK/STAT3通路增强非小细胞肺癌放射敏感性目的:探究抑制蛋白激酶CK2活性增强非小细胞肺癌放射敏感性的主要信号通路机制。方法:1、实时定量PCR法检测A549和H460细胞接受4Gy X线照射1h、6h和24h后IL-6 m RNA水平。2、Elisa酶联免疫吸附实验检测25μM醌茜素和X线照射后IL-6分泌量。3、Western blot法检测醌茜素和X线照射后细胞p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3的蛋白表达变化。4、克隆形成实验检测100 ng/ml IL-6和25μM醌茜素作用对细胞放射敏感性的影响。5、Western blot法检测100ng/ml IL-6和25μM醌茜素作用对细胞p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3的蛋白表达变化。结果:1、A549和H460在X线照射后IL-6 m RNA水平显著升高。2、醌茜素作用可抑制X线照射引起的IL-6分泌升高。3、醌茜素作用可抑制X线照射引起的p-JAK和p-STAT3的蛋白表达升高。4、醌茜素作用可降低IL-6处理引起的细胞放射抵抗。5、醌茜素作用可降低IL-6处理引起的p-JAK和p-STAT3的蛋白表达升高。结论:抑制蛋白激酶CK2活性主要通过抑制IL-6/JAK/STAT3通路增加非小细胞肺癌放射敏感性。