软枣猕猴桃快繁及遗传转化体系的建立

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软枣猕猴桃(Actinidia arguta)是猕猴桃科猕猴桃属大型落叶藤本植物,是近些年新兴起的一种小浆果,不光果实中含有丰富的营养,其果树也具有很高的观赏价值、药用价值及生态价值。目前软枣猕猴桃的野生资源逐渐减少,种植产业发展缓慢,随着消费需求量的增加,产量不足的问题愈发严重。且随着种植面积的增加,软枣猕猴桃缺少优良品系、环境适应性不强,及果实不耐贮藏等问题严重影响了产业的发展。本文探索软枣猕猴桃的多种快速繁殖方法,包括实生苗、压条育苗、丛生芽扩繁等短期内获得大量苗木的方法,建立了适合软枣猕猴桃的快繁体系;通过实验比较多种外植体材料的组培再生效率,建立了高效的组培再生体系;通过植物表达载体pCAMBIA3301-121的转化和转化效果检测建立软枣猕猴桃的遗传转化体系。主要结论如下:1.软枣猕猴桃可采用三种方法快速增殖。实生苗:种子用45℃水浴30分钟,用0.07%的赤霉素浸泡24小时,种子萌发率为82%;丛生芽扩繁:以茎段为外植体,MS基本培养基+6-BA(3 mg/L)+NAA(0.1 mg/L)的增殖系数为5.45;压条育苗:枝条经过0.02%的生根粉浸泡后,压条的生根率更高。2.软枣猕猴桃的幼嫩茎段作为外植体,用75%酒精浸泡30秒,0.2%氯化汞浸泡4分钟消毒,成活率为80%。实验以软枣猕猴桃的叶片、叶柄、茎段、子叶分别作为外植体,以MS(4.43 g/L)+蔗糖(30 g/L)+琼脂(7g/L)为基本培养基,诱导愈伤的培养基为:MS基本培养基+ZT(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L),其中茎段和子叶愈伤诱导率为100%,叶片愈伤诱导率为83.33%,叶柄愈伤诱导率为63.33%;诱导愈伤组织分化的培养基为:MS基本培养基+6-BA(3 mg/L)+NAA(0.1 mg/L),茎段和子叶愈伤组织分化率为96.67%,叶片愈伤组织分化率为10%,叶柄愈伤组织分化率为6.67%;诱导生根的培养基为:1/4 MS(2.21 g/L)+蔗糖(10 g/L)+琼脂(7 g/L),生根率为 96.67%。3.利用农杆菌转化法将表达载体pCAMBIA3301-121整合到软枣猕猴桃茎段基因组中。将茎段浸泡在EHA105农杆菌菌液中(OD600=0.6,含As20 mg/L)20分钟,然后共培养4天(温度为20±2℃,暗培养),用MS液体培养基(含Carb,500 mg/L)清洗,接种到添加了 Carb(400 mg/L)的诱导愈伤的培养基中约20天,然后放入选择培养基中进行筛选,每20天换1次增殖培养基并逐渐减少carb浓度,直至得到完整植株。
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