运动系统的疾病,例如肌腱撕裂,肌腱炎,骨缺损等尚无理想的治疗方法,影响着人们正常工作和生活。肌腱治疗方法相对滞后,主要原因是肌腱发育分化知识的缺乏。骨发育分化知识较为明了,但再生骨组织缺乏合适的物理支架及相关理论支持。间充质干细胞属于多能性干细胞,经化学或物理因素的诱导,可向骨系、肌腱系、脂肪系和软骨系等分化,是研究细胞分化的良好平台,是组织和器官修复的理想种子细胞。因此,本课题以间充质干细胞作为主要研究对象,分别对转录因子Mkx促进间充质干细胞向肌腱系分化的作用和机制以及仿生电纺羟基磷灰石-壳聚糖纳米纤维支架的物理结构促进间充质干细胞向骨系分化的作用和机制进行了相关研究。1.1转录因子Mohawk促进间充质干细胞向肌腱系分化的研究肌腱组织损伤后自我修复能力有限,修复后的肌腱常由瘢痕组织组成,组织结构和力学性能差,易重复断裂。目前对肌腱损伤的临床治疗进展缓慢,主要原因是对肌腱基本发育生物学知识的相对缺乏。因此,更好的认识肌腱发育和分化的生理学和分子信号网络,可为肌腱损伤的治疗提供新的方法和思路。此外,近年来,利用干细胞复合支架材料的组织工程手段修复肌腱的肌腱组织工程,是进行肌腱修复的新的方向,但缺乏合适的种子细胞。最近,有研究利用Mohawk (Mkx)转录因子敲除的小鼠,发现了Mkx在肌腱发育中的重要作用。但是,到目前为止,尚无有关Mkx在间充质干细胞向肌腱分化中的作用机制以及Mkx应用于肌腱修复的报道。因此,本课题旨在通过对转录因子Mkx在肌腱分化和再生中作用及机制的研究,为基本生物学提供新知识,为肌腱修复和再生提供新的思路。本论文研究内容及主要发现如下：第一章研究,检测了Mkx在肌腱炎,跟腱损伤自我修复过程,出生后跟腱发育过程和肌腱干细胞中的表达。发现Mkx参与肌腱正常生理状态的维持,肌腱发育过程,肌腱自我修复过程和肌腱干细胞表型的维持。第二章探索了Mkx在间充质干细胞向腱系分化中的功能和作用机制。主要发现有：1)通过检测过表达Mkx的间充质干细胞和形成的细胞片中基因表达和胶原纤维生长的变化,发现Mkx通过上调肌腱转录因子Scx和细胞外基质等腱系基因的表达,促进间充质干细胞向腱系分化。进一步研究发现了Mkx调控Scx表达的机制,即通过直接和TGFbeta2的promoter结合,促进TGFbeta2的表达。随后激活TGFbeta信号,上调Scx的表达。2)通过比较Mkx和Scx在胚胎期表达变化和成体跟腱中的表达分布,发现了Mkx和Scx在胚胎期和成体肌腱中表达的差异。随后我们比较了两者在促进间充质干细胞向腱系分化中功能的差异,结果显示Mkx的促腱系分化功能强于Scx,表现为对腱系基因的表达和胶原纤维生长的显著促进作用。因此,我们推测Mkx的作用机制为：一方面维持Scx表达,另一方面和Scx的蛋白共同作用,参与肌腱祖细胞的分化,促进肌腱细胞外基质的表达和胶原的生长和成熟,在腱系分化过程中起重要作用。第三章在前两部分对Mkx功能检测的基础上,以Mkx过表达的间充质干细胞作为种子细胞,构建组织工程化肌腱,并在肌腱损伤模型中评估其可行性和有效性。证实了Mkx高表达的间充质干细胞是肌腱组织工程的理想的种子细胞,形成组织工程化的肌腱后可有效地促进跟腱损伤再生。1.2仿生电纺羟基磷灰石-壳聚糖纳米纤维支架促进间充质干细胞向骨系分化的研究干细胞分化不仅受转录因子、生长因子等化学因素的调控,也受细胞外基质结构的影响。近期的研究显示,支架的物理结构影响间充质干细胞的成骨分化。在前期的研究中,我们研发了一种生物仿生骨材料即复合羟基磷灰石和壳聚糖的电纺纳米纤维(nHAp/CTS),然而这一材料促进干细胞向骨系分化的作用效果及相关机制尚不明确。因此,本项研究中,我们评估了nHAp/CTS对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化和骨再生的作用效果,并进行了相关机制的研究。主要发现为：1)较之膜状羟基磷灰石壳聚糖支架(mHAp/CTS)和单纯的壳聚糖电纺丝纳米纤维支架(nCTS), BMSCs在nHAp/CTS支架上具有更高的增殖效率,表明nHAp/CTS支架具有良好的生物相容性,促进细胞增殖。2) BMSCs在nHAp/CTS和mHAp/CTS支架上呈梭形,而在nCTS支架上呈圆形,表明HAp促进细胞骨架的调整及细胞的粘附。3) BMSCs种植支架上,骨诱导培养后,检测骨分化的关键信号通路-BMP信号通路中的相关分子Smad1, BMP2/4, Runx2, ALP等的表达,以及细胞外基质分子,细胞粘附分子及细胞骨架相关分子Ⅰ型胶原,整合素(integrin)和肌球蛋白(myosin)等基因的表达。结果显示,较之mHAp/CTS和nCTS组,nHAp/CTS组中,上述基因的表达水平有显著提升。此外,nHAp/CTS组,BMP信号通路中的p-Smad1/5/8明显入核,骨钙素(osteocalein, ocn)的表达显著提高。碱性磷酸酶(ALP)染色的结果同样支持了这一结论。在nHAp/CTS支架上,细胞有较高的ALP活性。这表明nHAp/CTS支架激活了BMSCs中integrin-BMP/Smad信号途径,促进了细胞向骨系分化。最后,我们建立了大鼠颅骨损伤模型,评估了nHAp/CTS复合BMSCs对骨缺损的修复效果。结果显示,nHAp/CTS/BMSCs组在骨缺损处形成了较多的新生骨,具有促骨再生的能力。上述结果表明,nHAp/CTS支架通过促进BMSCs的粘附,增殖,激活integrin-BMP/Smad信号途径,促进了BMSCs向骨分化和骨再生,表明支架的物理结构通过相关细胞信号通路影响了细胞骨化,并为nHAp/CTS支架在骨组织工程中的应用提供了有力的理论支持。