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苯乳酸（phenyllactic acid,PLA）是乳酸菌产生的一种新型抑菌物质,它不仅能够抑制多种食源性致病菌,而且对引起食品腐败的真菌具有广泛的作用。此外,苯乳酸稳定性高,安全无毒,有望开发成一种新型生物防腐剂应用于食品工业。国外对苯乳酸的研究尚处于初始阶段（1998-2008）,存在诸如乳酸菌种产量低、底物成本高和发酵时间长等问题。本文在国内率先对乳酸菌合成苯乳酸进行了系统的研究,主要内容包括:筛选高产苯乳酸的乳酸菌;研究其产生苯乳酸的途径和机理;优化乳酸菌生长细胞产生苯乳酸的发酵条件;研究影响乳酸菌静息细胞合成苯乳酸的因素;乳酸菌合成苯乳酸的酶进行分离、纯化并研究其酶学性质。利用MRS培养基发酵和HPLC检测,从中国传统发酵食品——泡菜中分离出一株高产苯乳酸的乳酸菌菌株,30℃培养72 h最高可产生91.3 mg/L的苯乳酸。通过形态学、生理生化及16S rDNA,初步鉴定为乳杆菌,命名为Lactobacillus sp.SK007,GenBankaccession number:DQ534529。系统发育分析表明,和植物乳杆菌亲缘关系最近。研究利用苯丙氨酸途径合成苯乳酸,提高苯丙氨酸的浓度可以增加苯乳酸的产量。以1.5g/L苯丙氨酸为底物的转化过程中发现:发酵72 h苯乳酸达到最高,而此时苯丙氨酸剩余94%、检测不到中间产物苯丙酮酸,这表明转氨反应是苯乳酸合成的限速步骤。进一步对影响转氨反应的因素进行研究,确定氨基受体α-酮戊二酸的缺乏是主要因素。研究了通过促进转氨反应提高苯乳酸的途径,分别采用添加α-酮戊二酸、谷氨酸以及柠檬酸和谷氨酸,苯乳酸产量有一定提高。苯丙氨酸的转氨反应已成为苯乳酸合成的瓶颈。在此基础上,使用苯丙酮酸替代同浓度的苯丙氨酸作为底物合成苯乳酸,结果苯乳酸产量提高了11倍、发酵时间缩短了48 h、原料成本降低了2/3。这表明,以苯丙酮酸为底物是苯乳酸合成的有利途径,为规模化生产提供了可能性。对乳杆菌的发酵条件进行了优化,用廉价的玉米浆代替昂贵的蛋白胨作为氮源。利用响应面法对培养基成分进行了优化,得到的培养基成分（g/L）:为葡萄糖30,玉米浆47,酵母粉5,磷酸氢二钟3,醋酸钠5,柠檬酸三铵2,硫酸镁0.58,硫酸锰0.25,吐温-80 3 mL,苯丙酮酸5。最适的培养温度30℃、接种量3%、静置培养。发酵过程中pH变化对苯乳酸影响很大,可采用添加0.5%的缓冲盐及中和剂进行内源调节。在发酵罐中,采用后期流加碱液控制pH的方法有利于苯乳酸合成。在此基础上进行了300 L发酵罐中试,苯乳酸产量达到2.81 g/L。利用乳酸菌静息细胞也可以合成苯乳酸,HPLC分析了静息细胞内、外的苯乳酸含量,结果表明绝大部分苯乳酸释放到转化液中。研究了细胞浓度、底物浓度、表面活性剂以及环境因素对苯乳酸产生的影响,得到的转化条件为:菌体静置培养24 h、用pH6.0的缓冲液收获细胞调节浓度为20g/L,加入2g/L苯丙酮酸,35℃、120 rpm反应2 h,苯乳酸产量可达0.98 g/L。静息细胞重复利用实验表明:第二次使用时,细胞活力仅为首次使用的20%,第三次已没有苯乳酸产生。进一步研究表明还原型辅酶NADH的缺乏是主要影响因素。针对反应过程中辅酶缺乏这一问题,构建了基于辅助底物的酶法再生体系。研究了葡萄糖、乙醇等辅助底物对苯乳酸合成的影响,确定葡萄糖是最适的辅助底物。在添加1%的葡萄糖,细胞重复利用5次活力仍能保持80%,细胞冷藏10天仍有60%的活力。经过超声波破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱和AKTAExplore Sephacryl S-200凝胶过滤等分离步骤,纯化得到乳酸脱氢酶（LDH）,SDS-PAGE呈现单一条带,HPLC检测纯度达98%。比酶活提高34.29倍、达到203.30 U/mg,回收率19.27%。在各纯化步骤中,该酶作用丙酮酸和苯丙酮酸的比值恒定,说明此酶是将苯丙酮酸还原成苯乳酸的主要酶。由SDS-PAGE得到LDH相对分子质量为39 kDa,而凝胶过滤色谱求得LDH的相对分子量约为80 kDa,因此,推断乳杆菌LDH分子内有2个亚基,是一种二聚体酶。圆二色性分析表明,LDH二级结构中α-旋占14.9、β-折叠35.7%、回转结构由为28.6%、无规卷曲为20.8。纯化的LDH作用苯丙酮酸的最适作用温度是40℃,超过60℃迅速下降;最适pH值为6.0、在4-8之间保持稳定;Mg2+、Mn2+对酶活力有促进作用,Cu2+、Hg2+对酶活力有不同程度的抑制作用。LDH对丙酮酸和苯丙酮酸的亲和力差别很大。采用Lineweaver-Burk法作图法,求得LDH作用丙酮酸和苯丙酮酸的米氏常数Km分别为0.31、1.69 mM。对10株乳杆菌的乳酸脱氢酶活力与其合成苯乳酸的能力进行了初步探讨,结果表明乳杆菌之间LDH对丙酮酸和苯丙酮酸的差别很大,对苯丙酮酸高的LDH乳杆菌产生了高的苯乳酸含量。因此,乳酸脱氢酶的活力可以作为筛选乳酸菌产生苯乳酸的标准之