论文部分内容阅读
目的:探讨高糖培养的人肾小管上皮细胞HK-2微小RNA-148b(miRNA-148b)对其靶基因AMPKα的表达变化,miRNA-148b表达变化对线粒体裂变蛋白DRP1及线粒体形态,线粒体内细胞色素c向胞质释放变化,细胞内活性氧(ROS)产生情况及细胞凋亡情况的影响,探讨高糖诱导肾小管损伤的发病机制,寻找新的治疗靶点.方法:体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,细胞同步化后按如下分组:(1)分为正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30.0 mmo/L葡萄糖)继续观察培养48h后,采用RT-PCR方法检测两组细胞内miRNA-148b的表达变化。(2)转染miR-148b inhibitor抑制miR-148b表达。分为正常糖组、高糖组、阴性对照高糖组(转染阴性对照+30.0 mmo/L葡萄糖)和转染miR-148b inhibitor高糖组(转染miR-148b inhibitor+30.0 mmol/L葡萄糖)培养48h,采用MitoTracker荧光染料在共聚焦显微镜下检测线立体形态变化;采用DCFH-DA荧光探针荧光显微镜下观察各组细胞活性氧产生情况;western blot技术用于检测AMPKα蛋白、DRP1蛋白、Cytochrome c蛋白、cleaved-caspase3蛋白的表达变化;采用Annexin v/FITC荧光染料在流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况。结果:(1)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组miR-148b表达显著增高(p<0.01)(2)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组AMPKα蛋白的表达下调,抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,AMPKα的表达有所上调,(p<0.05)但仍低于正常糖组。(3)干预刺激肾小管上皮细胞培养48h,与正常糖组相比,高糖组线粒体裂变相关蛋白DRP1表达增多(p<0.05),抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,线粒体裂变相关蛋白DRP1表达减少。(4)干预刺激肾小管上皮细胞培养48h,与正常糖组相比,高糖组细胞线粒体过度分裂,呈短棒状或点状,抑制高糖状态下miR-148b的表达后,线粒体的过度分裂被抑制,更多的恢复为线状和网状。(5)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组细胞内ROS产生增多,细胞色素C向胞质中释放增多,抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,细胞内ROS产生较减少,细胞色素C向胞质的释放减少。(6)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达增加(p<0.05),凋亡率增高;抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达减少,(p<0.05)凋亡率减低(p<0.05),。结论:(1)体外高糖条件下培养的人上小管上皮细胞miRNA-148b表达与正常糖组相比显著上调。(2)高糖状态下肾小管上皮细胞miRNA-148b的过表达,下调靶蛋白AMPKα的表达,线粒体分裂相关蛋白DRP1上调,促进线粒体分裂,ROS过度产生,细胞色素C释放,细胞凋亡。转染miRNA-148b inhibitor后可以上调靶基因AMPKα的表达,抑制线粒体分裂,抑制高糖状态下肾小管上皮细胞氧化应激亢进和凋亡,发挥肾脏保护作用,是治疗糖尿病肾病新的潜在靶点。