研究背景：缺血性脑卒中(ischemic cerebral stroke)是一种严重威胁人类健康的疾病,具有发病率高、致残率高及致死率高的特点。目前普遍认为实现早期缺血部位血流再灌注为救治该类患者的有效手段。但此治疗方式存在明显局限性：一方面可以实现缺血部位血流再灌,恢复缺血部位功能,缓解病情；另一方面易引发脑缺血再灌注损伤(ischemia and reperfusion injury, I/RI),使得病情进一步加重。I/RI是指缺血一段时间的组织经过治疗重新给予血流供应之后,不但未能及时促进缺血部位的功能恢复,反而进一步加重损伤的现象。I/RI可发生于多种疾病,除缺血性脑卒中外,肝脏缺血、肾脏缺血及心肌梗死等也普遍存在该现象。I/RI发生机制复杂,且受多种通路调控。研究表明氧化应激、钙超载、免疫调节以及炎症等均在其中发挥重要作用。由于调控机制复杂,缺少理想的药物进行干预,使得该类疾病预后较差。与此同时,表观遗传学在I/RI中发挥的功能越来越得到大家的重视。表观遗传学(epigenetics)已成为生命科学研究的热点,其主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰以及包括microRNA在内的非编码RNA对基因转录后水平的调控。常见的组蛋白修饰作用包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化和羧基化等,其中乙酰化修饰作为基因转录调控的重要机制,主要由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetylases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)共同调节；前者可以激活特定基因促进转录过程,后者则通过抑制基因启动子与转录调控元件的结合进而抑制转录。根据分子结构及表达区域的不同,HDACs分为4个家族：其中Ⅰ型家族(包括HDAC1,2,3,8).Ⅱ型家族(包括HDAC4,5,6,7,9,10)及Ⅳ型家族(HDAC11)为Zn2+依赖性酶,而Ⅲ类家族Sirtuins (SIRT1-7)为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依赖性酶。HDACs各亚型在生物体内发挥着各自特异性的生物功能,维持生理活动稳态。有报道证明,HDAC抑制剂(HDAC inhibitors, HDACis)在诸如阿尔兹海默及缺血性脑中风等神经系统疾病中具有保护作用。但是,目前应用于市场的HDACis多为非特异性、广谱性制剂。考虑到不同HDAC亚型在不同的疾病中发挥不同作用,广谱抑制剂的使用会不可避免导致副作用的发生。因此,深入研究不同HDAC亚型在缺血性脑卒中的具体作用十分必要。我们前期的研究表明在缺血性脑卒中大鼠模型中,缺血大脑中的HDAC4及HDAC5表达明显降低,而HDAC9表达明显升高。进一步研究表明,HDAC4及HDAC5可通过IMGB1通路保护神经元细胞。但是HDAC9功能尚不明确,因此阐明HDAC9在缺血性脑卒中的作用,可为设计特异性HDACis并应用于脑卒中治疗提供实验基础和理论依据,具有重要的临床意义。内皮细胞功能紊乱在缺血性疾病中的作用越来越引起人们的重视。在中枢神经系统中,内皮细胞与其临近细胞形成特有的血脑屏障(blood brain barrier, BBB),维持内环境稳态。发生脑I/RI后,内皮细胞功能明显受损,体现在炎性浸润明显、细胞凋亡加重、屏障功能降低等多个方面。研究表明,内皮细胞自噬(autophagy)在脑I/RI中发挥重要作用,并可能受到表观遗传学调控。自噬主要通过降解损伤及衰老的细胞器为细胞供能发挥其保护作用；同时自噬的过度激活会导致自噬性细胞死亡(autophagic cell death),加重细胞损伤。因此,阐明内皮细胞自噬在I/RI中的作用对于明确脑卒中损伤机制至关重要。因此,本实验主要通过体内实验及体外实验两部分,首次阐明了HDAC9在脑I/RI中的表达变化及作用,并发现HDAC9可通过调节内皮细胞自噬调控内皮细胞缺氧损伤。同时,在本课题中我们也通过构建大鼠肝脏缺血再灌注损伤,采用另一种常见的缺血性疾病模型研究HDAC9的作用,得到了一致的结论。研究目的：1、研究大鼠脑缺血再灌注损伤后HDAC9表达变化及其作用。2、探讨HDAC9加重缺氧条件下内皮细胞功能紊乱的机制。3、阐明HDAC9介导的内皮细胞自噬在缺氧条件下的作用。4、研究大鼠肝脏缺血再灌注损伤后HDAC9表达变化及其作用。研究方法：第一部分：大鼠脑缺血再灌注损伤后HDAC9表达变化及其作用1.1 HDAC9在大鼠脑缺血再灌注损伤后的表达变化1.1.1 Sprague-Dawley大鼠脑缺血再灌注模型建立及评价实验大鼠(250-280g)随机分组,建立脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-chloride three phenyl tetrazole, TTC)染色、神经学评分分别评价实验模型是否成功建立。1.1.2 HDAC9在脑皮层四种主要细胞的表达分布情况通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白质印迹(Western Blot)及组织免疫荧光染色三个方面分别检测HDAC9在脑皮层四种主要细胞中的表达分布情况。1.1.3大脑缺血再灌注损伤后HDAC9于大脑皮层中的表达变化情况通过实时逆转录-聚合酶链反应(Real time RT-PCR)及、Vestern Blot检测大脑缺血再灌注损伤后HDAC9表达变化情况。1.2大鼠脑立体定位注射慢病毒方式构建HDAC9基因沉默模型1.2.1 HDAC9基因沉默载体构建合成HDAC9短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA),构建重组慢病毒质粒以用于后续转染实验。1.2.2 HDAC9基因沉默大鼠模型构建采用大鼠脑立体定位注射慢病毒的方法建立HDAC9基因沉默动物模型,通过组织免疫荧光拍照、Western Blot检测HDAC9基因沉默效率,评估实验模型是否建立成功。1.3 HDAC9基因沉默对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制1.3.1 HDAC9基因沉默对大鼠脑缺血再灌注损伤后的影响HDAC9基因沉默大鼠分组后,行MCAO,模型构建成功后,通过大鼠TTC染色、水肿面积分析、神经学评分反映大鼠脑损伤整体程度,验证HDAC9基因沉默对于脑缺血再灌注损伤的作用。1.3.2 HDAC9基因沉默对大鼠血脑屏障损伤的作用1.3.2.1模型构建成功后,通过伊文氏蓝染色(evans blue staining)检测大脑皮层通透性变化,并通过透射电镜分析HDAC9基因沉默对于脑缺血再灌注后内皮损伤的作用。1.3.2.2 Western Blot检测各分组中大脑皮层组织中紧密连接蛋白(ZO-1, Occludin, Claudin-5)的表达变化。第二部分：IDAC9在内皮细胞损伤中的作用2.1 HDAC9在内皮细胞糖氧剥夺模型(Oxygen and Glucose Deprivation, OGD)中的表达变化2.1.1培养原代大鼠脑微血管内皮细胞(Brain Microvessel Endothelial Cells, BMVECs)。2.1.2 BMVECs经OGD处理后HDAC9表达变化BMVECs行OGD处理,于不同复氧时间点收集细胞,Western Blot检测HDAC9蛋白的表达变化。2.2 HDAC9基因沉默或过表达后对BMVECs在OGD条件下损伤的作用2.2.1细胞转染构建shRNA-HDAC9干扰及pGV230-HDAC9过表达质粒,分别转染内皮细胞,Western Blot检测转染效率。2.2.2 HDAC9对OGD处理后BMVECs损伤的影响BMVECs转染后行OGD处理,检测BMVECs功能变化情况。采用Real time RT-PCR方式检测BMVECs炎性因子变化,并通过流式细胞仪检测BMVECs凋亡变化。阐明HDAC9对于OGD条件下BMVECs损伤的作用。2.3 HDAC9对于BMVECs通透性的影响2.3.1体外BMVECs通透性实验BMVECs种植于特定小室中,shRNA-HDAC9转染后行OGD处理,复氧24小时后检测BMVECs通透性变化。2.3.2 HDAC9对于BMVECs紧密连接蛋白的影响BMVECs行shRNA-HDAC9转染,通过免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1的变化情况,并采用Western Blot处理后的内皮细胞紧密连接蛋白(ZO-1,Occludin,Claudin-5)的变化。第三部分：HDAC9介导的自噬在BMVECs OGD损伤中的作用3.1 HDAC9对BMVECs自噬的调控作用分别使用shRNA-HDAC9干扰质粒及pGV230-HDAC9过表达质粒转染内皮细胞。、Vestern Blot检测经OGD处理后自噬相关蛋白LC3及p62的变化,Real time RT-PCR检测p62 mRNA改变,并通过透射电镜检测HDAC9对于BMVECs自噬小体数目的影响。3.2自噬激活对于BMVECs OGD损伤的影响通过经典哺乳类雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin, mTOR)通路的抑制剂-雷帕霉素(Rapamycin)激活自噬。体外内皮细胞通透性实验检测自噬激活后BMVECs通透性变化,同时通过Real time RT-PCR检测BMVECs炎性因子变化,证明自噬在内皮细胞OGD损伤中的作用。第四部分：大鼠肝脏缺血再灌注损伤后HDAC9表达变化与作用4.1 HDAC9于大鼠肝脏I/RI后的表达变化4.1.1大鼠肝脏I/R模型建立及评价Sprague-Dawley大鼠(250-280g)随机分组,建立大鼠I/R模型。通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE staining)评价模型是否建立成功。4.1.2大鼠肝脏I/RI后HDAC9的表达变化建模成功后,通过免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)及Western Blot检测大鼠肝I/RI后HDAC9表达变化。4.2 HDAC9对大鼠肝脏I/RI后内皮细胞功能紊乱的影响4.2.1大鼠肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)培养本实验采用肝窦内皮细胞RC-RM-0037(上海诺辰生物技术公司)作为研究对象。4.2.2 HDAC9在LSECs经OGD处理后的表达变化LSECs行OGD处理,复氧24小时后收集细胞,Western Blot检测HDAC9的表达变化。4.3 HDAC9基因沉默对LSECs OGD损伤的影响4.3.1细胞转染LSECs使用shRNA-HDAC9转染,Western Blot检测转染效率。4.3.2 HDAC9在LSECs OGD损伤中的作用LSECs转染成功后行OGD处理,使用流式细胞仪检测细胞凋亡变化,证明HDAC9对于OGD条件下LSECs损伤的影响。实验结果：第一部分：大鼠脑缺血再灌注损伤后HDAC9表达变化及其作用1.1 HDAC9在大鼠脑I/RI后的表达变化及作用1.1.1大鼠脑I/R模型建立及评价雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)随机分组,通过MCAO建立脑I/R模型。1.1.2 HDAC9在脑皮层中四种主要细胞的表达分布情况通过免疫荧光双标法对大脑皮层组织切片进行染色,通过NeuN标记神经元细胞、CD34标记内皮细胞、GFAP标记星形胶质细胞及CDl1b标记小胶质细胞,结果表明HDAC9广泛表达于以上四种细胞中,并在小胶质细胞中表达较低。该结果进一步通过RT-PCR及Western Blot检测得以验证。1.1.3大鼠脑I/RI后HDAC9于大脑皮层中的表达变化情况通过Real time RT-PCR及、Western Blot实验表明,大鼠脑I/RI后,HDAC9表达明显升高并呈时间依赖性。1.2大鼠脑立体定位注射慢病毒构建HDAC9基因沉默模型1.2.1 HDAC9基因沉默载体构建为研究HDAC9在大鼠脑I/RI中的作用,我们首先需要建立HDAC9基因沉默大鼠,通过大鼠HDAC9基因测序,构建shRNA-HDAC9慢病毒表达载体,shRNA-HDAC9序列为ATCATCCTGAGGTCTGTCC。 1.2.2 HDAC9基因沉默大鼠模型构建采用大鼠脑皮层立体定位仪注射重组的包备有shRNA-HDAC9的慢病毒载体pGLV3/H1/GFPtPuro (pGLV3)介导大鼠HDAC9基因沉默,通过文献查阅及实验自身改进,确定大鼠注射点。本实验采用两点注射的方法,均注射左侧大脑皮层。第一点位置：前囟前1.0-2.0毫米,中线外侧3.0毫米,注射深度为3.0毫米；第二点位置：前囟后0.5-1.5毫米,中线外侧3.5毫米,注射深度为3.5毫米。通过前期的预实验,确定转染剂量为每只大鼠9微升慢病毒或者阴性转染病毒。注射速度为每分钟0.5微升。每次注射完成后留置针头10分钟以防止病毒倒流。大鼠慢病毒转染1周后,通过冰冻切片监测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP),发现GFP广泛表达于左侧大脑半球皮层中。为进一步研究慢病毒转染的具体细胞,通过大脑组织冰冻切片免疫荧光的方法,标记GFP荧光蛋白并与NeuN标记的神经元细胞、CD34标记的内皮细胞、GFAP标记的星形胶质细胞及CDl1b标记的小胶质细胞进行荧光双标,结果表明GFP广泛表达于以上四种细胞。取转染区域的大脑皮层,与假手术组及阴性对照组对比,Western Blot检测发现慢病毒转染后HDAC9表达明显降低。1.3 HDAC9基因沉默对大鼠脑I/RI的影响及作用机制1.3.1 HDAC9基因沉默对大鼠脑I/RI的影响慢病毒转染大鼠1周后行MCAO模型,于再灌注48小时后麻醉处死,取材,分析实验数据。大鼠脑I/RI后神经学损伤评分明显升高,证明模型构建成功,而HDAC9基因沉默后评分较模型组明显降低。同时TTC染色表明HDAC9基因沉默后脑梗死区域明显降低。以上结果表明HDAC9升高可加重大脑I/RI损伤。1.3.2 HDAC9基因沉默对大鼠血脑屏障损伤的作用通过伊文氏蓝染色的方法检测血脑屏障,实验发现大鼠脑I/RI后脑组织内伊文氏蓝外渗量明显升高,而HDAC9基因沉默后外渗量明显降低。内皮细胞是构成血脑屏障的主要细胞。通过透射电镜拍照发现在大鼠I/RI后,内皮细胞肿胀明显,细胞核肿胀形态异常,血脑屏障的整齐性受到破坏,内皮细胞周围水肿吞噬小泡明显增多,膜结构受损严重。而HDAC9基因沉默后内皮细胞损伤有所减轻,紧密连接破坏得以恢复。进一步使用Western Blot检测表明大鼠I/RI后,紧密连接蛋白(ZO-1, Occludin, Claudin-5)表达明显降低,而HDAC9基因沉默后紧密连接蛋白表达明显恢复。以上结果表明证明HDAC9升高可加重内皮细胞损伤,破坏血脑屏障。第二部分：HDAC9在内皮细胞损伤中的作用2.1内皮细胞糖氧剥夺模型建立该部分实验使用原代大鼠脑微血管内皮细胞建立模型。2.2 BMVECs经OGD处理后HDAC9表达变化BMVECs行OGD处理1小时后,不同复氧时间点收取细胞。Western Blot结果显示HDAC9于OGD后表达明显升高并具有时间依赖性,选取升高明显的24小时为后续实验时间点。2.3 HDAC9基因沉默或过表达后对BMVECs OGD损伤的影响通过shRNA-HDAC9质粒干扰HDAC9, Western Blot检测发现转染效率。BMVECs转染成功后行OGD处理,复氧24小时后,Real time RT-PCR检测炎性因子,流式细胞术检测细胞凋亡。实验结果表明HDAC9基因沉默后,OGD条件下BMVECs炎性因子表达明显降低,同时细胞凋亡明显减少。证明HDAC9升高可加重BMVECs OGD损伤。2.4 HDAC9对于BMVECs细胞通透性的影响2.4.1体外内皮细胞通透性实验内皮细胞通透屏障损伤是缺血再灌注损伤的重要方面。内皮细胞通透性分析发现HDAC9基因沉默后能够明显降低BMVECs细胞透过性。2.4.2 HDAC9对于内皮细胞紧密连接蛋白的影响通过免疫荧光染色ZO-1蛋白发现,HDAC9基因沉默后明显恢复BMVECsZO-1表达。同样的结论通过Western Blot检测检测紧密连接蛋白(ZO-1,Occludin, Claudin-5)得以进一步证实。第三部分：HDAC9介导的细胞自噬在BMVECs OGD损伤中的作用3.1 HDAC9对于内皮细胞自噬的调控作用内皮细胞经OGD处理后,于不同复氧时间点收取细胞样本。Western Blot检测发现OGD处理后自噬水平明显升高,HDAC9基因沉默后LC3-Ⅱ向LC3-I转化进一步升高,同时p62蛋白水平进一步降低。Real time RT-PCR检测发现HDAC9基因沉默对p62 mRNA水平无明显影响。BMVECs诱导HDAC9高表达后,Western Blot检测发现HDAC9过表达后LC3蛋白转化明显降低,进一步通过透射电镜检测发现HDAC9过表达后,BMVECs中自噬小体数目明显减少。以上结果均证明HDAC9可以负调控BMVECs自噬活性。3.2自噬激活对于BMVECs OGD损伤的影响Rapamycin激活自噬后,内皮细胞通透性分析发现Rapamycin处理能够明显降低BMVECs细胞透过性。Real time RT-PCR检测发现Rapamycin处理可明显降低BMVECs OGD条件下的炎性因子释放,减轻炎性反应。以上结果证明细胞自噬在BMVECs OGD条件发挥保护作用。第四部分：HDAC9在大鼠肝脏缺血再灌注损伤后的表达变化及作用4.1 HDAC9于大鼠肝脏I/RI后的表达变化4.1.1大鼠肝脏I/R模型建立及评价实验大鼠(250-280g)随机分组,使用动脉夹阻并阻断尾状叶及左肝叶的血流,从而造成70%的肝脏缺血,缺血1小时后松开动脉夹实现血流再灌,建立大鼠肝脏I/R模型。通过HE染色发现,Sham组大鼠肝脏颜色正常,无炎性浸润,镜下无异常改变。I/R组镜下发现细胞肿胀,炎性浸润及片状坏死出现,表明模型建立成功。4.1.2 HDAC9于大鼠肝脏I/RI后表达变化通过IHC染色及Western Blot发现,大鼠肝脏I/RI后,肝脏组织内]HDAC9表达明显升高。4.2 HDAC9对大鼠肝脏I/RI中内皮功能紊乱的影响4.2.1大鼠肝窦内皮细胞培养本实验采用肝窦内皮细胞LSECs RC-RM-0037(上海诺辰生物技术公司)作为研究对象。4.2.2 HDAC9于LSECs OGD处理后的表达变化LSECs行OGD处理,复氧24小时后收集细胞,Western Blot检测发现HDAC9蛋白表达明显升高。4.3 HDAC9基因沉默对LSECs OGD损伤的影响4.3.1细胞转染shRNA-HDAC9转染内皮细胞,并采用Western Blot检测转染效率。4.3.2 HDAC9对LSECs OGD损伤的影响LSECs经HDAC9转染后行OGD处理,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果发现HDAC9基因沉默可明显降低内皮细胞OGD条件下的凋亡数量。结论与创新性：1、HDAC9于大鼠脑缺血再灌注损伤后表达明显升高,HDAC9可明显加重大鼠脑梗死面积,破坏血脑屏障,从而加重大鼠脑缺血再灌注损伤。2、HDAC9可促进内皮细胞炎性,增加内皮细胞凋亡和增强细胞通透性,加重内皮细胞缺氧损伤。3、HDAC9可通过介导自噬来影响内皮细胞功能,自噬升高可明显降低内皮细胞通透性及炎性反应,发挥保护作用。4、HDAC9于大鼠肝脏缺血再灌注损伤后表达明显升高并且HDAC9基因沉默可明显减轻肝窦内皮细胞损伤,提示HDAC9在缺血性组织损伤中起到相同的作用。