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初生仔猪产热不足,主要依赖电能供暖,造成巨大能源损耗和经济损失。大多数哺乳动物体内存在棕色脂肪可进行非战栗产热,以应对寒冷环境。UCP1是棕色脂肪最直接分子标记,棕色脂肪非战栗产热的本质就是UCP1蛋白介导的解偶联呼吸产热。PGC-1α是线粒体生成和线粒体能量代谢重要的调控因子,在UCP1功能发挥及哺乳动物非战栗产热过程中起着重要的调控作用。哺乳动物如人、羊和小鼠体内都存在棕色脂肪,但猪是否存在棕色脂肪,一直存在争议。通过探究仔猪产热不足的分子机制,并修复初生仔猪产热功能,不仅可以解决长期以来猪是否存在棕色脂肪的争议,并且对于人类医学解析由于肥胖引起的相关疾病如糖尿病等研究具有一定启示。获得的小鼠UCP1和猪PGC-1α基因发生同源重组阳性单克隆胎儿成纤维细胞,可用于制备寒冷耐受非战栗产热的转基因猪,为未来培育节能减排型猪新品种提供供体细胞。本研究以猪为研究对象,制备猪UCP1特异抗体,探究猪UCP1基因是否发生转录、翻译,明确猪体内是否存在棕色脂肪;其次以猪前体脂肪细胞为研究对象通过检测细胞氧气消耗量变化明确过表达UCP1和PGC-1α基因后细胞发生棕色化获得解偶联呼吸功能,并通过蛋白质免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀技术探究其棕色化的分子机制;最后通过构建同源重组载体,通过CRISPR/Cas9技术在猪基因组H11位点定点插入外源基因,筛选获得可用于体细胞核移植的阳性猪胎儿成纤维细胞,获得主要结果如下:1、通过3’RACE试验获取猪UCP1基因的转录本,发现UCP1基因在猪体内仅有外显子1、2发生转录;通过制备猪UCP1特异性的抗体,检测发现1日龄和7日龄仔猪体内各个部位脂肪组织均不表达UCP1蛋白,即仔猪体内不存在棕色脂肪。2、分别在前体脂肪细胞中过表达猪UCP1、小鼠UCP1、猪PGC-1α、猪UCP1+猪PGC-1α、小鼠UCP1+猪PGC-1α,检测细胞中线粒体生成、细胞解偶联呼吸率和线粒体的能量代谢。透射电子显微镜和定量PCR结果表明过表达猪PGC-1α组、猪UCP1+猪PGC-1α组、小鼠UCP1+猪PGC-1α组前体脂肪细胞线粒体生成显著增加(P<0.01);定量PCR和WB结果表明猪PGC-1α能增加前体脂肪细胞线粒体能量代谢相关基因FABP1、CPT1β、ACOX1、MCAD、Cyt C、ATP Synthase和COX III的表达(P<0.01);细胞氧气消耗检测结果表明猪PGC-1α增加细胞线粒体能量代谢;小鼠UCP1和猪PGC-1α同时过表达后不仅增加线粒体能量代谢、更能使前体脂肪细胞获得解偶联呼吸的功能、并显著提高棕色和米色脂肪标志基因Lhx8、Zic1、Cidea、PDK4、CD137和SLC27a1的表达(P<0.05),促使细胞发生棕色化;同时定量PCR结果显示,过表达PGC-1α和小鼠UCP1基因的前体脂肪细胞与单独过表达PGC-1α的前体脂肪细胞相比,细胞中棕色/米色脂肪标志基因PDK4,CD137和SLC27a1与能量代谢相关功能基因CPT-1β和ATP合酶表达显著上调(P<0.05),Lhx8显著下调(P<0.05)。3、前体脂肪细胞过表达小鼠UCP1和猪PGC-1α后,PGC-1α能够促进细胞线粒体生成,在这个过程中PGC-1α能够介导UCP1转运镶嵌到线粒体内膜发挥解偶联呼吸功能,UCP1蛋白的解偶联呼吸降低细胞ATP水平,激活pAMPK,pAMPK可以直接增加PGC-1α的磷酸化,同时可以通过增加SIRT1的表达使得PGC-1α去乙酰化,增加PGC-1α的活性,PGC-1α作为辅助转录因子与转录因子Lhx8、Zic、PPARα和ERRα相互作用,分别调控下游基因CPT-1β、PDK4、TFAM和SLC27a1的表达,最终增加细胞线粒体能量代谢和细胞的棕色化。4、筛选获得猪PGC-1α和小鼠UCP1基因同源重组阳性单克隆猪胎儿成纤维细胞:构建脂肪组织特异表达猪PGC-1α和小鼠UCP1基因同源重组载体、表达sgRNA和Cas9蛋白的pX330载体,通过CRISPR/Cas9技术在猪脂肪细胞基因组H11位点定点进行同源重组,结果表明同源重组载体不仅能够在脂肪细胞中表达出猪PGC-1α和小鼠UCP1蛋白,并且使其获得解偶联呼吸能力,通过CRISPR/Cas9技术在猪胎儿成纤维细胞基因组H11位点定点插入同源重组片段,筛选获得了可用于转基因猪制备的阳性单克隆细胞。