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背景Six1(sine oculis homeobox 1)是Six家族中的一员,据报道,它参与人体许多组织器官的生长发育,比如肾脏,肌肉组织,听觉系统和视觉系统。近年来研究表明,Six1的高表达与很多肿瘤的发生发展有关,包括乳腺癌,霍奇金淋巴瘤,子宫颈癌,骨髓瘤,肝细胞癌,卵巢癌,结直肠癌等。已经证实,Six1不仅在结直肠癌细胞的增殖中发挥着重要作用,而且在调控结直肠癌细胞的迁移中也扮演着至关重要的角色,但具体的分子机制少有报道。目的1.验证Six1对结直肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。2.探究Six1影响结直肠癌细胞增殖和迁移的具体分子机制,并加以证实。方法1.Six1对结直肠癌细胞增殖能力的影响用Six1真核表达载体(pXJ-40-Six1)和Six1-siRNA分别转染结直肠癌细胞系HCT116和LoVo中,分别以2000个细胞/孔的密度接种到96孔板中,通过MTT法测定在结直肠癌细胞系HCT116中过表达Six1对该细胞系增殖的影响以及Six1基因沉默对结直肠癌细胞系LoVo增殖的影响。2.Six1对结直肠癌细胞迁移的影响将Six1过表达的结直肠癌细胞HCT116-Six1细胞和Six1基因沉默的结直肠癌细胞LoVo-siSix1细胞接种到6孔板中,然后在6孔板的底部划出笔直痕迹,拍照记录痕迹的愈合情况,通过计算划痕愈合的距离评估结直肠癌细胞的迁移能力。将Six1过表达的结直肠癌细胞HCT116细胞和Six1基因沉默的结直肠癌细胞LoVo过夜培养,更换为含有双抗但无血清的培养液培养,胰酶消化,计数,在每个Transwell细胞小室中铺入5万个细胞检测发生迁移的结直肠癌细胞数目的变化,即通过迁移至Transwell小室外侧的细胞数量来证实结直肠癌细胞处理前后迁移能力的改变,结晶紫染色并清洗小室后,将小室放置于倒置显微镜下拍照记录,然后计算出各组发生迁移的细胞总个数和各组细胞的迁移率,并依据计算的数值作图分析各组细胞是否发生迁移能力的变化3.探究Six1促进结直肠癌细胞增殖和迁移的分子机制将Six1过表达的结直肠癌细胞HCT116细胞和Six1基因沉默的结直肠癌细胞LoVo细胞在恒温细胞培养箱培养48h,然后水平小心取出细胞培养板,将其置于冰上提取细胞的总蛋白,通过Western blot检测通路关键蛋白例如JNK,p53,Wnt,AKT,p38和AMPKα等,并在后续实验中通过加入可能发挥作用的信号通路的特异性激活剂或者是抑制剂,以进一步确认在结直肠癌细胞增殖和迁移过程中该可疑的信号通路是否发挥作用。结果1.Six1可以增强结直肠癌细胞HCT116的增殖能力MTT法分析Six1过表达或者干扰后对结直肠癌细胞增殖能力的影响。结果表明,Six1过表达组细胞所测得的OD值均显著高于对照组数值,Six1组活细胞数目及总的细胞活力相比空白对照组要高出2倍左右,说明结直肠癌细胞的增殖活动在很大程度上受结直肠癌中Six1过表达的影响,即存在明显地促进作用,相反,Six1基因沉默组的吸光度值均显著低于对照组,说明Six1基因沉默组活细胞数目及总的细胞活力显著低于对照组,即Six1基因沉默对于结直肠癌细胞的增殖有明显地抑制作用。2.Six1可以提高结直肠癌细胞的迁移潜能细胞划痕愈合实验结果表明,培养相同时间内,HCT116-Six1细胞划痕愈合的距离要比对照组HCT116细胞长;同样地,Transwell细胞迁移实验结果显示,HCT116细胞中过表达Six1组相对于空白对照组,细胞的迁移速率较高。相反,在结直肠癌细胞LoVo中,Six1基因沉默组与正常对照组相对比,结直肠癌细胞的迁移受到明显抑制。这些实验结果表明了过表达Six1可以促进结直肠癌细胞的迁移,Six1基因沉默可以抑制结直肠癌细胞的迁移。3.Six1通过激活/抑制Wnt/β-catenin信号通路进而影响结直肠癌细胞的增殖和迁移Western blot结果显示,过表达Six1的结直肠癌细胞中,常见信号通路的关键分子p-JNK,p-P53,p-AKT,p-P38和p-AMPKα蛋白的表达水平均未呈现出明显变化,然而,在结直肠癌细胞中过表达Six1后,Wnt/β-catenin信号通路中的关键分子β-catenin核内移增加,继而Wnt/β-catenin通路由于Six1表达量的增高而激活,加入Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂xav939之后,该信号的活化程度即β-catenin核内移的程度显著降低,同时对结直肠癌细胞的增殖和迁移能力起到了一定的抑制作用。同理,在结直肠癌细胞中Six1基因沉默后,β-catenin核内移减少,继而Wnt/β-catenin通路由于Six1表达量的降低而活性降低,在加入激活剂后,信号的活化程度则显著升高,并且也提升了结直肠癌细胞的增殖以及迁移能力。综上所述,我们的实验结果显示,Six1很有可能通过激活Wnt信号通路促进结直肠癌细胞增殖和迁移。结论本课题证实了在结直肠癌细胞中,Six1过表达能够显著促进结直肠癌细胞的增殖和迁移,Six1基因沉默可以明显抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移。进一步研究发现了Six1可能是通过Wnt通路发挥促进结直肠癌细胞增殖和促进结直肠癌细胞迁移的作用,这将很有可能为结直肠癌患者的治疗提供新的方向。