论文部分内容阅读
[背 景]脑缺血（cerebral ischemia）又称缺血性脑卒中、脑中风,是一种以脑组织缺血缺氧引起的神经组织损伤及相应的神经功能障碍为主要临床表现的急性脑血管病。尽管基础和临床研究已经对脑缺血性损伤的发病机理和治疗措施进行了多年的研究,但是目前临床上仍然缺乏有效的治疗方案。肢体远距缺血后处理（remote limb ischemic post-conditioning,RLIPostC）已被证明在脑缺血中具有神经保护作用,但其分子机制尚需进一步揭示。[目 的]研究RLIPostC对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用,以及对脑缺血半影区内突触再生的作用,并初步探讨其分子机制。[方 法]采用左侧大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfushion,MCAO/R）方法复制 Sprague-Dawley（SD）大鼠脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury）模型,随机分为假手术组（sham组）,模型对照组（model组）,远距缺血后处理组（RLIPostC组）、PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组（LY组）、远距缺血后处理+PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组（RLIPostC+LY组）。RLIPostC组在再灌注后立即接受3个循环的RLIPostC治疗（双侧股动脉缺血10 min+再灌注10 min为1个循环）。RLIPostC+LY组大鼠在MCAO前30 min经侧脑室立体定位注射PI3K/Akt通路抑制剂LY294002（剂量25 mmol/L于5μl的DMSO）,后进行MCAO复制模型,再灌注后立即接受3个循环的RLIPostC处理,LY组在MCAO前30 min经侧脑室立体定位注射25 mmol/L PI3K/Akt通路抑制剂LY294002共5 μl,其余步骤与RLIPostC+LY组相同。所有动物在脑缺血再灌注损伤后第7 d和第14 d分别通过Rogers神经功能缺损评分、foot-fault测试和水迷宫评估神经功能恢复水平。在脑缺血再灌注损伤后第14 d,采用焦油紫（cresyl violet,CV）染色测量脑梗死体积,通过脑组织干湿比重测量脑水含量,运用免疫荧光染色观测突触数量,Western-Blotting检测突触再生相关突触结构的标志性蛋白——突触前突触素蛋白 Syn1（Synapsin 1,Syn1）和突触后致密物质（Post synaptic density protein 95,PSD95）,以及生长相关蛋白（growth associatedprotein-43,GAP43）蛋白表达量的变化。[结 果]与脑缺血再灌注对照组（Model组）比较,肢体远距缺血后处理促进了脑中风大鼠的神经功能恢复,包括减轻了脑中风大鼠神经功能缺失症状（P<0.05）,增强运动协调能力（P<0.05）和学习记忆能力（P<0.05）的恢复;形态学检测结果表明RLIPostC处理减少了脑梗塞体积（RLIPostC组35.02%±2.321%vs.Model组 50.67%±4.926%,P<0.05）和脑水肿（RLIPostC 组 80.40%±3.19%vs.Model组 86.91%±2.03%,P<0.05）;Western boltting 检测结果表明,与Model 组比较,RLIPostC处理增加了 SYN1蛋白和PSD95的表达,并上调GAP43的表达;免疫荧光检测突触前和突触后标志蛋白结果表明,RLIPostC处理显著增加突触前标志蛋白Synl的荧光强度（相对于假手术组的倍数:RLIPostC组1.22±0.38 vs.Model组0.58±0.42,P<0.05）及突触后PSD95的荧光强度（相对于假手术组的倍数:RLIPostC 组 1.41±0.39 vs.Model 组 0.57±0.32,P<0.05）。应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理后,尽管肢体远距缺血后处理仍能表现出改善大鼠神经功能恢复（RLIPostC+LY组vs.Model组,P<0.05）,但是保护作用减弱（RLIPostC+LY 组vs.LY 组,P<0.05）;同样在 PI3K/Akt 通路阻断下 RLIPostC仍然具有减少脑梗死体积的作用,但是保护效果也被减弱（RLIPostC+LY组vs.Model 组,P<0.05;RLIPostC+LY组vs.LY 组,P<0.05）,而且 RLIPostC 减轻脑水肿的作用被消除（RLIPostC+LY组vs.LY组P>0.05）,进一步的Western boltting检测结果表明RLIPostC增加缺血半影区内神经突触相关蛋白Syn1、PSD95和GAP43的作用仍然存在,但是作用也被减弱（RLIPostC+LY组vs.Model组,P<0.05;RLIPostC+LY组vs.LY 组,P<0.05）。[结 论]（1）大鼠脑缺血再灌注后立即实施的双侧后肢RIPostC可增强大鼠行为功能的恢复,包括促进神经功能缺失症状、运动协调能力、学习和记忆能力的恢复;（2）脑缺血再灌注后立即实施的双侧后肢RIPostC可减少脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积,减轻脑水肿的程度;（3）大鼠脑缺血再灌注后立即实施的双侧后肢RIPostC上调脑缺血半影区内神经突触前标志蛋白Syn1、突触后标志蛋白PSD95及突触再生相关蛋白GAP43的表达;（4）大鼠脑缺血再灌注后立即实施的双侧后肢RIPostC增加脑缺血半影区内突触前标志蛋白Syn1和突触后标志蛋白PSD95的阳性荧光强度;（5）PI3K/Akt通路抑制剂LY294002可减弱双侧后肢RIPostC的神经保护作用和促进突触再生作用。