背景子宫腺肌症是一种常见的子宫良性疾病,影响19.5%的育龄妇女。其组织病理学特征是子宫肌层出现异位子宫内膜组织（子宫内膜腺体和间质）。临床表现包括盆腔疼痛、子宫异常出血和不孕。尽管其发病率高、症状严重,但其病因和发病机制尚不清楚。目前文献中主要有两种理论:其一基于组织损伤和修复机制的失调,该机制促进细胞迁移和子宫内膜基底层向肌层的内陷;另一种理论认为,子宫腺肌症是胚胎多能苗勒氏残体化生或成体干细胞分化的结果。子宫腺肌症虽是一种良性疾病,但却有恶性肿瘤侵袭转移的特征。迁移和侵袭被认为是子宫腺肌症进展和扩散的关键因素。既往研究表明,上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在恶性肿瘤的侵袭和转移中起关键作用,而其与子宫腺肌症发病机制的关系也受到越来越多的关注。EMT,即上皮细胞表型发生改变,丢失主要上皮细胞特征,表达间质细胞标志物,并获得侵袭转移能力的过程。在多种生理及病理环境中均可观察到EMT现象的发生,包括正常的胚胎生长和组织形成,组织修复重构,纤维化及肿瘤进展等。上皮细胞中细胞黏附标记物钙粘蛋白E（E-cadherin）表达丧失以及伴随的间质标记物钙粘蛋白N（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达增加是EMT的标志。在子宫腺肌瘤病变中,与正常子宫内膜（对照组）相比,上皮细胞中E-cadherin表达降低,Vimentin和N-cadherin表达升高,提示EMT可能促进子宫腺肌瘤病变侵袭和进展。然而,子宫腺肌症中触发EMT的机制尚未阐明。巨噬细胞在不同的微环境中可能有不同的极化倾向。经典的二分类巨噬细胞活化表型包括M1和M2型;M1型巨噬细胞具有促炎功能,而M2型被认为是抗炎巨噬细胞。一氧化氮合酶2（iNOS）、TNF-α、IL-12通常被作为M1型巨噬细胞标记,而 CD163、精氨酸酶-1（Arginase,Arg-1）、TNF-β、IL-10 常被认为是M2型巨噬细胞标记。研究表明,在肿瘤微环境中存在大量肿瘤相关巨噬细胞（TAM）,其活化状态类似M2巨噬细胞;TAM能够产生多种细胞因子,促进恶性肿瘤细胞存活、血管生成以及转移,促进EMT的发生。而子宫腺肌症患者的在位子宫内膜中存在巨噬细胞聚集。因此,我们推断巨噬细胞参与了子宫腺肌症的形成。miRNAs是一种单链非编码RNA,可与靶mRNA结合并干扰翻译过程。已经证实,有多种miRNA在子宫内膜异位症中差异表达,这些miRNA通过靶向基因参与子宫内膜异位症的发展,但我们对miRNAs在子宫腺肌症中的作用尚不清楚。细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的小囊泡,它们存在于生物体液中,其内包裹着蛋白质、脂质和遗传物质等,允许在细胞间交换,参与细胞间通信。最近的研究表明,EVs参与了肿瘤相关巨噬细胞（或M2极化巨噬细胞）和EMT相关事件。EVs中的miRNAs可以调控巨噬细胞极化,促进EMT,是调控肿瘤生长及转移、血管生成、化疗敏感性和免疫逃逸的信号分子。基于以上研究背景,在本研究中,我们假设子宫腺肌症来源的EVs可以促进巨噬细胞极化,最终促进子宫内膜上皮细胞发生EMT。我们将以原代子宫内膜上皮细胞、Ishikawa细胞、THP-1来源巨噬细胞、人外周血来源单核巨噬细胞作为体外研究对象,探讨子宫腺肌症来源的EVs及其内的miRNA在巨噬细胞极化及子宫腺肌症发病中可能的作用,以期为子宫腺肌症的病因和治疗提供新的理论依据。第一部分 子宫腺肌症来源细胞外囊泡对巨噬细胞极化状态的影响目的从原代子宫内膜间质细胞培养上清中提取细胞外囊泡（EVs）,探讨其对巨噬细胞极化状态的影响。材料和方法1.免疫组化法验证子宫腺肌症患者和对照组患者在位内膜中M2型巨噬细胞的聚集情况临床选择绝经前且至少3个月以上未接受激素治疗且无系统性疾病,接受子宫切除术或腺肌症病灶切除+诊断性刮宫的子宫腺肌症患者作为实验组（n=21）;患有输卵管梗阻性不孕但没有其他系统疾病,接受宫腹腔镜联合手术或宫腔镜输卵管通液手术,围手术期排除子宫腺肌症、子宫内膜异位症的女性作为对照组（n=10）（山东大学齐鲁医院科研伦理委员会,批准号:KYLL-2020（KS）-177）。获取实验组和对照组女性的在位内膜组织。福尔马林固定后,免疫组化染色法检测CD163阳性巨噬细胞的表达。2.分离并鉴定原代子宫内膜细胞来源EVs首先分离培养人原代子宫内膜间质细胞。收集实验组和对照组女性的在位子宫内膜组织,严格无菌操作,用酶解法培养原代子宫内膜间质细胞。筛选细胞活力旺盛的第1-3代细胞进行后续实验。用试剂盒法自原代子宫内膜间质细胞培养上清中分离EVs。使用电子透射显微镜、纳米颗粒示踪分析技术（NTA）、Western blot鉴定EVs。3.培养巨噬细胞及鉴定实验对象为人THP-1细胞系来源巨噬细胞和人原代单核巨噬细胞。THP-1细胞（人外周血单核细胞系）经PMA刺激后贴壁,成为巨噬细胞,细胞免疫荧光法鉴定THP-1来源巨噬细胞。获取人抗凝血标本,对倍稀释后加入淋巴细胞分离液,密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）。CD14+磁珠分选法获得单核细胞,M-CSF刺激下培养7天,获得原代人外周血单核巨噬细胞。细胞免疫荧光法鉴定原代人外周血单核巨噬细胞。4.验证THP-1来源巨噬细胞和原代人外周血单核巨噬细胞对EVs的摄取红色的PKH26标记的EVs与巨噬细胞作用12小时,CD68标记巨噬细胞,DAPI染料染细胞核,荧光显微镜观察巨噬细胞的吞噬作用。5.检测EVs对巨噬细胞极化状态的影响分别将子宫腺肌症组患者在位子宫内膜来源EVs、对照组女性在位子宫内膜来源EVs、添加或不添加GW4869（中性鞘磷脂酶非竞争性抑制剂）后的子宫腺肌症组原代子宫内膜间质细胞培养上清作用于THP-1来源巨噬细胞和原代人外周血单核巨噬细胞。48小时后提取RNA,qRT-PCR法检测CD163、IL-10、iNOS和TNF-α mRNA含量。ELISA检测巨细胞培养上清中细胞因子的浓度。结果1.M2型巨噬细胞在子宫腺肌症在位内膜中聚集免疫组化结果显示,与对照组相比,子宫腺肌症患者的在位内膜中存在CD163阳性巨噬细胞聚集现象。2.EVs的鉴定透射电镜下显示,细胞外囊泡呈圆形或椭圆形,中央色深,外圈色浅。外观类似茶托,周围有一圈更明亮的亮圈。NTA显示,检测样本中的颗粒平均直径为167.4±77.5 nm,平均浓度为9.8*10^8颗粒/ml。Western blot显示,EVs高表达CD63、TSG101,不表达Calnexin。加入抑制剂GW4869后,EVs表达CD63、TSG101、CD81蛋白水平降低。3.巨噬细胞鉴定THP-1来源巨噬细胞及原代单核巨噬细胞表达巨噬细胞标记CD68,在THP-1来源巨噬细胞中以红色荧光标记,在原代单核巨噬细胞中以绿色标记。细胞核均标为蓝色。两种巨噬细胞贴壁后,部分细胞长出触角,原代单核巨噬细胞的触角更明显。4.巨噬细胞可以摄取EVs荧光显微镜下观察,经PKH26标记为红色的EVs聚集在巨噬细胞膜内（绿色）、细胞核（蓝色）周围。5.子宫腺肌症来源EVs可以诱导巨噬细胞向M2b方向极化qRT-PCR显示,经子宫腺肌症来源EVs刺激后,THP-1来源巨噬细胞高表达CD163、IL-10、TNF-α mRNA,iNOS mRNA有下降趋势,但无统计学意义。经子宫腺肌症组的原代子宫内膜细胞培养上清刺激后,THP-1来源巨噬细胞高表达 CD163、IL-10、TNF-α mRNA,低表达 iNOS mRNA;加入 GW4869 后高表达iNOS mRNA。经子宫腺肌症来源EVs和子宫腺肌症原代子宫内膜细胞培养上清刺激后,原代人单核巨噬细胞与THP-1来源巨噬细胞有相同的极化趋势。ELISA显示,经子宫腺肌症来源的EVs刺激后,THP-1来源巨噬细胞培养上清中IL-10、TNF-α细胞因子的浓度升高。结论1.与对照组女性相比,CD163阳性巨噬细胞（M2巨噬细胞）在子宫腺肌症患者的在位内膜中聚集。2.子宫腺肌症来源EVs可以诱导巨噬细胞向M2b方向极化。第二部分 M2b巨噬细胞促进原代子宫内膜上皮细胞发生EMT的研究目的探讨细胞外囊泡（EVs）刺激后的巨噬细胞对子宫内膜上皮细胞EMT和迁移能力的影响。材料和方法1.免疫组化法检测实验组和对照组在位内膜中腺上皮EMT标记物的表达获取对照组和实验组的在位子宫内膜组织,福尔马林固定后,免疫组化染色法检测 Vimentin、E-cadherin 的表达。2.免疫荧光法鉴定原代子宫内膜上皮细胞收集实验组和对照组女性的在位子宫内膜组织,严格无菌操作,用酶解法培养原代子宫内膜上皮细胞。相对于原代子宫内膜间质细胞,上皮细胞数量少且无法传代,需新鲜组织提取,现提现用。原代子宫内膜上皮细胞表达上皮标记CK7,应用免疫荧光法将其以绿色荧光标记;DAPI将细胞核以蓝色标记。3.EVs刺激后的巨噬细胞与上皮细胞共培养,Western blot检测上皮细胞EMT的表达EVs刺激THP-1来源巨噬细胞48小时后,将刺激后的巨噬细胞与原代子宫内膜上皮细胞共培养48小时,Western blot检测原代子宫内膜上皮细胞EMT相关蛋白 N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 和 CK7 蛋白的表达。EVs刺激THP-1来源巨噬细胞48小时后,将刺激后的巨噬细胞与Ishikawa细胞共培养48小时,Western blot检测Ishikawa细胞中EMT相关蛋白N-cadherin、E-cadherin 的表达。4.EVs刺激后的巨噬细胞与上皮细胞共培养,Transwell检测上皮细胞迁移能力的改变使用24孔板及配套的TranswellTM小室,Transwell法检测原代子宫内膜上皮细胞、Ishikawa细胞迁移能力的改变。5.EVs刺激后的巨噬细胞与上皮细胞共培养,Western blot检测上皮细胞中PTEN、p-AKT、AKT 的表达共培养方法同步骤3,Western blot检测原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞中PTEN、p-AKT、AKT的表达。结果1.子宫腺肌症患者的在位内膜腺上皮细胞存在EMT现象免疫组化染色显示,与对照组相比,子宫腺肌症患者的在位子宫内膜组织中腺上皮细胞Vimentin表达上调,E-cadherin表达下调。2.原代子宫内膜上皮细胞的鉴定荧光显微镜下观察,上皮细胞的细胞质被染为绿色,细胞核染为蓝色。细胞数量少时,原代子宫内膜上皮细胞多聚团生长,形成似玫瑰花样的细胞团。细胞数量多时,原代子宫内膜上皮细胞可铺满培养板。3.子宫腺肌症来源EVs刺激后的巨噬细胞诱导原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞发生EMT与经对照组EVs处理的巨噬细胞相比,经子宫腺肌症来源EVs处理的巨噬细胞与子宫腺肌症患者的原代子宫内膜上皮细胞、或对照组原代子宫内膜上皮细胞、或Ishikawa细胞共培养后,原代上皮细胞表达N-cadherin和Vimentin蛋白升高,E-cadherin和CK7蛋白下降;Ishikawa细胞表达N-cadherin蛋白升高,E-cadherin蛋白下降。提示上皮细胞发生了 EMT。4.子宫腺肌症来源EVs刺激后的巨噬细胞增强原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞的迁移能力与经对照组来源EVs处理的巨噬细胞相比,经子宫腺肌症来源EVs处理的巨噬细胞与子宫腺肌症患者的原代子宫内膜上皮细胞、或对照组原代子宫内膜上皮细胞、或Ishikawa细胞共培养后,以上三种上皮细胞穿过Transwell上室膜的细胞数量增多,提示上皮细胞的迁移能力提高。5.当上皮细胞发生EMT时,PTEN表达下调,p-AKT/AKT表达上调子宫腺肌症来源EVs刺激后的巨噬细胞与子宫腺肌症患者的原代子宫内膜上皮细胞、或对照组原代子宫内膜上皮细胞、或Ishikawa细胞共培养后,上皮细胞中PTEN表达下调,p-AKT/AKT的比值上调。提示EMT的发生与PTEN下调以及AKT通路激活有关。结论1.子宫腺肌症患者的在位内膜腺上皮细胞存在EMT现象。2.子宫腺肌症来源EVs处理的巨噬细胞可以诱导包括子宫腺肌症组、对照组女性在内的原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞发生EMT。3.上皮细胞EMT的发生可能与PTEN下调及AKT通路的激活有关。第三部分 子宫腺肌症来源细胞外囊泡可以通过miR-25-3p诱导巨噬细胞极化,极化的巨噬细胞诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT目的从候选miRNA中筛选子宫腺肌症来源细胞外囊泡（EVs）和对照组EVs中差异表达的miRNA。验证筛选出的miRNA对巨噬细胞极化及子宫腺肌症在位内膜上皮细胞EMT的作用。材料和方法1.血清来源EVs的分离及鉴定从第一部分及第二部分的实验组中随机选取11名患者作为实验组（n=11）;原第一部分及第二部分的对照组患者仍作为本部分研究的对照组（n=10）,收集血清样本。按照试剂盒操作,提取血清来源EVs。透射电子显微镜观察EVs形态,NTA 检测 EVs 的粒径,Western blot 检测 EVs 中 TSG101、CD63、Calnexin的表达。2.检测子宫腺肌症原代间质细胞上清来源EVs和对照组EVs刺激后的巨噬细胞中 miR-21、miR-25-3p、miR-301a-3p 的表达情况根据前两部分研究结论及既往文献,选定miR-21、miR-25-3p、miR-301a-3p为初始研究对象。qRT-PCR检测经子宫腺肌症原代间质细胞培养上清来源EVs和对照组原代间质细胞培养上清来源EVs刺激后的巨噬细胞中miR-21、miR-25-3p、miR-301a-3p 的表达情况。3.检测子宫腺肌症患者血清来源EVs和对照组血清来源EVs中miR-21、miR-25-3p的表达情况根据上一步骤结果,qRT-PCR检测子宫腺肌症患者血清来源EVs和对照组血清来源EVs中miR-21、miR-25-3p的表达情况。4.检测子宫腺肌症原代间质细胞上清来源EVs和对照组EVs中miR-25-3p的表达情况根据上一步骤结果,qRT-PCR检测子宫腺肌症原代间质细胞培养上清来源EVs和对照组原代间质细胞培养上清来源EVs中miR-25-3p的表达情况。5.转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞中,检测转染效率转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞后,qRT-PCR检测巨噬细胞中miR-25-3p表达量增加和压低的情况。6.检测转染miR-25-3p mimics或inhibitor后巨噬细胞极化标记物的表达转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞后,qRT-PCR法检测巨噬细胞中 CD163、IL-10、Arginase-1（Arg-1）、iNOS 和 TNF-α mRNA 的表达。ELISA检测转染后的巨噬细胞培养上清中IL-10、TNF-α的浓度。7.检测转染miR-25-3p mimics或inhibitor后巨噬细胞中PTEN的表达转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞后,Western blot检测转染后的巨噬细胞中PTEN蛋白的表达情况。8.转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞中,与上皮细胞共培养后,检测上皮细胞EMT标记物的表达转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞后,将转染后的巨噬细胞与实验组或对照组的原代子宫内膜上皮细胞共培养,Western blot检测原代子宫内膜上皮细胞中 N-cadherin、Vimentin、E-cadherin 和 CK7 蛋白的表达。转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞中,与Ishikawa细胞共培养后,Western blot 检测 Ishikawa 细胞 N-cadherin、E-cadherin 的表达。9.转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞中,与上皮细胞共培养后,检测上皮细胞迁移能力的改变转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞后,将转染后的巨噬细胞与子宫腺肌症患者的原代子宫内膜上皮细胞、或对照组原代子宫内膜上皮细胞、或Ishikawa细胞共培养,Transwell检测原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞迁移能力的改变。10.转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞中,与上皮细胞共培养后,检测上皮细胞中PTEN、p-AKT、AKT的表达转染miR-25-3p mimics或inhibitor至巨噬细胞后,将转染后的巨噬细胞与子宫腺肌症患者的原代子宫内膜上皮细胞、或对照组原代子宫内膜上皮细胞、或Ishikawa细胞共培养,Western blot检测原代上皮细胞及Ishikawa细胞中PTEN、p-AKT、AKT 的表达。结果1.血清来源EVs的鉴定透射电镜下显示,血清来源EVs外观类似茶托,与细胞上清来源EVs无明显差别。NTA显示,EVs的平均直径为143.2±50.2 nm,平均浓度为2.7*10^10颗粒/ml,从血清中提取的EVs浓度高于细胞上清。Western blot显示,EVs高表达 CD63、TSG101,不表达 Calnexin。2.子宫腺肌症原代间质细胞上清来源EVs刺激后的巨噬细胞高表达miR-25-3p、miR-21与对照组EVs刺激的巨噬细胞相比,经子宫腺肌症在位内膜原代间质细胞上清来源EVs刺激的巨噬细胞中高表达miR-21、miR-25-3p,miR-301a-3p有升高趋势,但无统计学意义。3.子宫腺肌症患者血清来源EVs高表达miR-25-3p与对照组相比,miR-25-3p在子宫腺肌症患者血清EVs中高表达;miR-21有升高趋势,但无统计学意义。4.子宫腺肌症原代间质细胞上清来源EVs高表达miR-25-3p与对照组女性的在位内膜原代间质细胞培养上清来源EVs相比,子宫腺肌症患者的原代间质细胞培养上清来源EVs高表达miR-25-3p。5.巨噬细胞转染miR-25-3p mimics或inhibitor效率的检测与转染mimics对照相比,转染miR-25-3p mimics后巨噬细胞内miR-25-3p表达量明显升高;与转染inhibitor对照相比,转染inhibitor后巨噬细胞内miR-25-3p表达量明显被压低。提示转染有效。6.miR-25-3p诱导巨噬细胞向M2方向极化将miR-25-3p mimics转染巨噬细胞后,qRT-PCR检测结果显示巨噬细胞高表达 CD163、IL-10、Arg-1 mRNA,低表达 TNF-α及 iNOS mRNA。ELISA 显示IL-10表达增加,TNF-α表达下降。提示巨噬细胞向M2方向极化。将miR-25-3p inhibitor转染巨噬细胞后,巨噬细胞低表达CD163、IL-10、Arg-1 mRNA,高表达TNF-α及iNOS mRNA。ELISA显示IL-10表达下降,TNF-α表达增加,提示巨噬细胞向M1方向极化。7.miR-25-3p在巨噬细胞中可能靶向PTEN转染miR-25-3p mimics后,巨噬细胞中PTEN的表达下调;反之,转染miR-25-3p inhibitor后,巨噬细胞中PTEN的表达上调。8.miR-25-3p诱导极化后的巨噬细胞可以促进上皮细胞发生EMTmiR-25-3p mimics转染巨噬细胞,并与原代子宫内膜上皮细胞或Ishikawa细胞共培养后,原代子宫内膜上皮细胞N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高,E-cadherin 和 CK7 蛋白表达下降;Ishikawa 细胞 N-cadherin 表达升高,E-cadherin表达下调。9.miR-25-3p诱导极化后的巨噬细胞可以增强上皮细胞的迁移能力miR-25-3p mimics转染巨噬细胞,并与原代子宫内膜上皮细胞或Ishikawa细胞共培养后,原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞的迁移能力均增强。10.PTEN及AKT通路可能参与上皮细胞的EMT过程当EMT发生时,原代子宫内膜上皮细胞及Ishikawa细胞中PTEN表达下调或有下调趋势,p-AKT/AKT表达上调或有上调趋势。结论1.miR-25-3p在子宫腺肌症在位子宫内膜来源EVs和对照组女性在位子宫内膜来源EVs中存在差异表达,并可以诱导巨噬细胞发生M2极化。2.miR-25-3p诱导极化的巨噬细胞反过来可以促进子宫内膜上皮细胞发生EMT。3.子宫腺肌症在位子宫内膜来源EVs和对照组女性在位子宫内膜来源EVs中可能存在多种差异表达miRNA。