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本论文研究目的是利用帕拉金糖(palatinose)不易被植物细胞和大多数微生物利用且食用安全等特点,将其作为基因转化的筛选剂,其相应的酶基因作为标记基因,两者共同构建一个新的生物安全转基因选择系统。主要研究内容结果如下:
(1)从土样中筛选得到可利用帕拉金糖为唯一碳源且酶活高的P4菌株,经形态、生理生化特征分析及16SrDNA基因序列(1455bp)与Genebank序列比对,P4菌与产酸克雷伯氏菌的基因序列同源性高达100％,确定该菌株为产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)。
(2)DNS比色法测定菌体培养的胞外液和胞内液活性,并进行帕拉金糖诱导活性实验,确定帕拉金糖降解酶(palatinase)为胞内诱导酶,帕拉金糖为诱导剂。
(3)TLC法对帕拉金糖降解酶的酶解产物进行定性分析,TLC条件为:正丁醇:冰醋酸:乙醚:水=9:6:3:1,苯胺-二苯胺显色,展开高度6cm。相应的葡萄糖、果糖和帕拉金糖的Rf值分别为0.36、0.33和0.22,酶解产物为葡萄糖和一未知产物,Rf值为0.47。
(4)利用电泳技术对帕拉金糖降解酶进行分离。比较P4菌未诱导与诱导样品的SDS-PAGE电泳结果,发现凡经帕拉金糖诱导的样品均在约50kDa处产生一特异蛋白带。用Native-PAGE电泳分离帕拉金糖降解酶,切胶回收得到38个样品,总回收率为68.4％,其中3、8、28和35号样品蛋白质含量较高,经Native-PAGE电泳检测为单一条条带。用DNS比色法对4个样品进行帕拉金糖降解酶活性检测,经反应后比色确定28号样品有帕拉金糖降解酶活性。