肝癌是一种全球性的高发病率和高死亡率的恶性肿瘤。其中,肝癌转移是其导致死亡的最主要原因。因此有效预防和治疗肝癌受到了广泛关注,对肝癌转移的细胞和分子机制的研究将有助于缓解肝癌对人类的威胁。肿瘤转移包括一系列连续事件,主要包括上皮间充质细胞转换(EMT),肿瘤迁移,抵抗失巢凋亡,血管和淋巴管发生。其中,肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的能力是指肿瘤细胞脱离基质后能够抵抗由整合素等诱导的凋亡。失去这种能力的肿瘤细胞脱离细胞基质后会在包含局部粘着斑激酶等因子的作用下发生凋亡。抵抗失巢凋亡的能力使得肿瘤细胞能够在脱离基质后进入血液循环,到达远处器官后再贴壁、生长增殖。因此肿瘤对失巢凋亡的抵抗能力在肿瘤转移中发挥重要作用。然而,肿瘤细胞抵抗失巢凋亡能力的分子调控机制研究尚未完全阐明。本课题组在前期的研究中利用多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂(poly HEMA)铺板使肝癌细胞脱离基质而悬浮生长的特性,成功构建了肝癌转移的细胞模型；并使用基因芯片比对贴壁生长和悬浮生长的肝癌细胞后发现,Bcl-2nineteen-kilodalton interacting protein3, BNIP3在悬浮生长的肝癌细胞中表达明显上调。BNIP3属于BCL2家族的一类非典型的、仅有BH3结构域的促凋亡蛋白家族成员,它的表达水平主要受低氧诱导因子HIF-1α (hypoxia inducible factors-1α, HIF-1α)的调控。BNIP3在恶性胶质瘤、宫颈癌等许多肿瘤组织中表达上调,而在胰腺导管癌中表达下调。BNIP3在肝癌转移中的功能及机制至今尚不明确。本课题成功构建了人BNIP3真核表达和靶向BNIP3的shRNA表达载体,验证了两种载体的有效性,并检测了其对自噬的影响。同时,我们利用肝癌转移的细胞模型,明确了BNIP3在悬浮肝癌细胞中的表达情况及其分子调控机制；通过对AKT/ERK和mTOR等信号通路的研究进一步确定了BNIP3能够通过自噬介导肝癌细胞抵抗失巢凋亡能力的效应和机制。通过对BNIP3对肝癌细胞抵抗失巢凋亡分子机制的研究,为临床上判断肝癌预后及靶向治疗提供了新的思路和方法。目的1构建人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体,验证其有效性及其对肝癌细胞自噬的影响。2在失巢前后的肝癌细胞中检测BNIP3的表达情况,并同时检测自噬的发生情况。3研究抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中调控BNIP3表达的分子机制及BNIP3与自噬之间相互作用的分子调控机制。4研究BNIP3在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中发挥作用的分子机制。方法1人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞自噬的影响1.1人BNIP3的真核表达载体和shRNA表达载体的构建与验证从人肝癌细胞系BEL7402中,通过RT-PCR扩增人BNIP3基因编码区序列,酶切后插入pcDNA3.1-His-C载体,以此构建重组的pcDNA3.1-BNIP3真核表达载体。同时构建靶向人BNIP3基因的shRNA表达载体pSilencer-BNIP3。分别经测序、酶切、RT-PCR和Western blot等方法对重组载体是否构建成功进行验证。1.2研究人BNIP3的真核表达载体和shRNA表达载体对肝癌细胞自噬的影响肝癌细胞系BEL7402稳定传代后以1.5×105／孔的细胞数接种于12孔板,在75%汇合度时进行细胞转染。将BNIP3真核表达载体和ShRNA表达载体分别按Lipofectamine2000TM转染说明书(每孔中质粒的转染量为2.4u g,脂质体4.8μL)转染进入肝癌细胞24h后提取总蛋白,通过采用Western blot检测自噬标志物LC3蛋白的剪切,研究BNIP3过表达和抑制时对肝癌细胞自噬的影响。2动态模拟肝癌细胞转移的过程2.1肝癌转移的细胞模型的建立肝癌细胞系BEL7402使用加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液,在37℃、5%CO2培养条件下培养条件下培养至对数生长期,使用含0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化成单细胞悬液,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液终止消化并调整细胞悬液密度至3×105/L后,加入在紫外灯下照射过夜晾干的poly-HEMA(终浓度3.6mg/cm2)培养板中继续培养24h,得到失巢状态的肝癌细胞。2.2动态模拟肝癌细胞转移过程取对数生长期的BEL7402细胞,使用含0.02%EDTA的胰酶的消化成单细胞悬液后,用含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至3×105/mL,然后按正常细胞培养板的体积要求将单细胞悬液分别加入普通培养板和poly HEMA板中,在5%CO2、37℃的培养箱中培养24h,普通培养板中培养的正常贴壁生长的肝癌细胞和poly HEMA板中悬浮培养的肝癌细胞分别为贴壁组和悬浮组,分别模拟肝癌在原发灶和脱离细胞外基质附着后进入血管转移时的细胞状态。同时,将poly HEMA板悬浮培养的肝癌细胞转入普通培养板中再培养24h,即为悬浮转贴壁组,模拟转移状态的肝癌细胞到达继发灶部位的细胞状态。3抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3表达的分子调控机制研究3.1检测BNIP3在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的表达情况应用肝癌转移的细胞模型悬浮培养肝癌细胞24h后分成两组,一组直接提取总mRNA和总蛋白,一组再转入普通培养板中贴壁生长24h后提取总mRNA和总蛋白,两组均以同样培养条件下的贴壁生长24h的肝癌细胞所提取的总mRNA和总蛋白为对照组,分别通过RT-PCR和Western blot检测了悬浮组的肝癌细胞和悬浮培养转贴壁组肝癌细胞相对贴壁组肝癌细胞中BNIP3在mRNA和蛋白水平上的变化情况。肝癌细胞分别悬浮培养和贴壁生长24h和48h时提取蛋白,用Western blot检测悬浮组的肝癌细胞中相对贴壁生长的肝癌细胞中BNIP3的表达变化。3.2失巢状态的肝癌细胞中BNIP3表达变化的调控机制应用RT-PCR和Western blot检测悬浮培养24h和悬浮24h后再转入普通培养板中贴壁生长24h的肝癌细胞系BEL7402中BNIP3上游调控因子HIF-1α的mRNA和蛋白表达变化；同时应用Western blot检测了ERK信号通路的变化。应用Western blot检测肝癌细胞系BEL7402悬浮培养1h、3h、8h和24h后HIF-1α的蛋白表达变化。为了进一步证实ERK信号通路在BNIP3表达调控中的作用,在失巢状态的肝癌细胞系BEL7402中分别加入ERK抑制剂U0126(终浓度10μM)和PD98059(终浓度10μM)悬浮培养18h,用Western blot检测封闭ERK通路后HIF-1α和BNIP3的表达变化。4自噬在抵抗失巢凋亡肝癌细胞中的效应及分子调控机制的研究4.1肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中自噬的发生和效应研究肝癌细胞系BEL7402分为三组：悬浮培养24h组、悬浮培养24h后转贴壁生长24h组和贴壁生长24h组用Western blot检测悬浮培养的肝癌细胞中自噬发生的变化。肝癌细胞系BEL7402分为悬浮培养和贴壁生长两组,分别在悬浮或贴壁培养1h、3h、8h和24h提取蛋白用Western blot检测肝癌细胞自噬发生的水平。肝癌细胞系BEL7402悬浮培养18h后加入自噬抑制剂3-MA(终浓度5mM)培养6h,通过与DMSO对照组中自噬水平的比较,确定3-MA对悬浮培养的肝癌细胞自噬的抑制效用,然后用cck8检测3-MA对失巢后肝癌细胞活性的影响和台盼蓝检测3-MA对失巢后的肝癌细胞的凋亡效应。4.2抵抗失巢凋亡的肝癌细胞自噬的分子调控机制研究肝癌细胞系BEL7402分为三组：悬浮培养24h组、悬浮培养24h后转贴壁生长24h组和贴壁生长24h组用Western blot检测悬浮培养的肝癌细胞中mTOR通路的变化。肝癌细胞系BEL7402分为悬浮培养和贴壁生长两组,分别在培养后1h、3h、8h和24h后提取蛋白用Western blot检测肝癌细胞中mTOR通路的变化。肝癌细胞在分别转染si-BNIP3和共转染si-BNIP3和pcDNA-LC3-GFP24h后,再转入肝癌转移的细胞模型悬浮培养24h,用Western blot检测BNIP3对悬浮培养的肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3的影响。在肝癌转移的细胞模型中使用mTOR通路的激活剂insulin(100nM)和rapamycin (100nM)分别刺激或共刺激24h,用Western blot检测失巢后肝癌细胞的mTOR通路的磷酸化和自噬标志蛋白LC3的活性剪切体LC3Ⅱ。5BNIP3在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中的分子机制研究5.1BNIP3小干扰RNA si-BNIP3的封闭效果验证肝癌细胞系系BEL7402稳定传代后以1.5×105/孔的细胞数接种于12孔板,在75%汇合度时进行细胞转染。将BNIP3的小干扰RNA si-BNIP3及其对照si-NC分别按Lipofectamine2000TM转染说明书(每孔中siRNA的转染量为40p mol,脂质体2μL)转染进入肝癌细胞24h后提取总蛋白,应用Western blot检测si-BNIP3对BNIP3的封闭效果。5.2si-BNIP3对肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中自噬的作用效应研究肝癌细胞系BEL7402分别在转染si-BNIP3和共转染si-BNIP3和pcDNA-LC3-GFP24h后,分别再转入肝癌转移的细胞模型悬浮培养24h后,用Western blot检测BNIP3对悬浮培养的肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3的影响。5.3si-BNIP3在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的效应及机制研究肝癌细胞系BEL7402在转染si-BNIP324h后,再转入肝癌转移的细胞模型悬浮培养24h,分别应用cck8试剂盒和台盼蓝染色法检测失巢后肝癌细胞中的细胞活性；应用Caspase-3/cpp32比色法试剂盒和Western blot检测Caspase-3的活化蛋白。6统计学分析结果用mean±SD表示,各组之间差别的统计学意义用T检验或者one-way ANOVA进行统计,P<0.05被认为有统计学意义。结果1人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体的构建1.1成功构建pcDNA3.1-BNIP3表达载体和pSliencer-BNIP3表达干扰载体经测序、酶切、RT-PCR和Western blot等方法证实重组载体pcDNA3.1-BNIP3构建成功；经测序、real time PCR和Western blot等方法证实shRNA表达载体pSliencer-BNIP3构建成功。转染pcDNA3.1-BNIP3后能够在肝癌细胞中高表达BNIP3蛋白,而转染pSliencer-BNIP3后能够有效抑制肝癌细胞中BNIP3的表达。1.2BNIP3分子能够调控肝癌细胞中自噬的发生分别将pcDNA3.1-BNIP3表达载体和pSliencer-BNIP3表达干扰载体转染入肝癌细胞系BEL7402,培养48h后使用Western blot检测肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3证实pcDNA3.1-BNIP3高表达BNIP3蛋白能够显著增强肝癌细胞自噬,而pSliencer-BNIP3抑制BNIP3蛋白的表达后,能够显著性减少肝癌细胞自噬的发生。2动态模拟肝癌细胞在体内的转移过程2.1成功建立肝癌转移的细胞模型在普通培养板中常规培养的BEL7402细胞在培养板表面伸展,贴壁生长成单层细胞；而肝癌细胞在悬浮培养18h后,光镜下已可见细胞变圆且相互聚集成团,在24h时细胞聚集程度更高。因此,一般采用悬浮培养18-24h的肝癌细胞进行相关实验。2.2动态模拟肝癌细胞转移过程悬浮转贴壁组在从肝癌转移的细胞模型中悬浮培养24h后转入普通培养板中生长24h,肝癌细胞贴壁且呈伸展状态生长,与正常贴壁生长的肝癌细胞形态一致。而悬浮组细胞保持在肝癌转移细胞模型中的细胞形态。通过该模型的建立,我们成功模拟了体内肝癌细胞转移的过程：贴壁组模拟肝癌原发灶,悬浮组模拟肝癌在血管或淋巴管转移时的细胞状态,而悬浮转贴壁组则模拟肝癌在到达继发灶部位时的细胞生长状态。3抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的高表达受ERK/HIF-1a通路的调控3.1BNIP3和HIF-1α在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中高表达失巢后的肝癌细胞中BNIP3和HIF-1α在mRNA和蛋白水平上均高于正常贴壁组和失巢后再贴壁组肝癌细胞(P<0.0001)。在24h和48h检测贴壁组和悬浮组肝癌细胞中BNIP3的表达水平,结果显示BNIP3在贴壁组中低表达且无时间依赖性,而BNIP3在悬浮肝癌细胞组中高表达,且表现出时间依赖性。在悬浮培养48h的肝癌细胞相对悬浮培养24h的肝癌细胞中BNIP3的表达显著增加。3.2ERK通路在在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中活化且通过ERK/HIF-1a通路调控BNIP3的表达经Western blot验证,悬浮培养的肝癌细胞中ERK磷酸化水平显著高于贴壁组和失巢后再贴壁组肝癌细胞(P<0.0001)。在肝癌转移的细胞模型中分别加入ERK抑制剂UO126(终浓度10μM)和PD98059(终浓度10μM)悬浮培养18h后,Western blot检测结果显示ERK通路磷酸化水平明显降低,同时HIF-1a和BNIP3的表达显著降低。4失巢后的肝癌细胞通过mTOR通路调控的自噬维持存活4.1失巢后的肝癌细胞通过自噬维持存活Western blot证实自噬标志蛋白LC3的活性剪切体LC3Ⅱ在悬浮组肝癌细胞中表达增加,且其在不同时间点(1h,3h,8h和24h)的表达均高于贴壁组细胞,提示脱离胞外基质的附着能够激活肝癌细胞的自噬。应用自噬的抑制剂3MA抑制自噬后,能够逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗。4.2肝癌细胞通过mTOR通路介导的自噬抵抗失巢凋亡经Western blot验证,mTOR通路的信号分子p-mTOR、p-S6K1、p-S6和p-4EBP1在悬浮组细胞中表达均有不同程度的降低。在不同时间点提取的蛋白检测中,悬浮细胞中mTOR通路关键信号分子mTOR、S6K1和S6的磷酸化水平均显著下调,提示悬浮后mTOR通路的活化受到显著性抑制。mTOR激活剂insulin能够降低失巢后肝癌细胞的自噬水平,而其抑制剂rapamycin的作用则相反。该结果提示失巢后的肝癌细胞通过抑制mTOR通路、上调细胞的自噬水平并进一步抵抗失巢凋亡。5BNIP3介导的自噬使肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡的能力5.1si-BNIP3封闭肝癌细胞中BNIP3的表达经Western blot验证,在转染si-BNIP324h后能够完全封闭BNIP3在肝癌细胞中的表达。5.2si-BNIP3抑制抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的中自噬将si-BNIP3对肝癌细胞进行转染后24h后,将转染细胞进行失巢处理,并检测失巢后肝癌细胞中自噬的标记物LC3的剪切水平,以此反应细胞的自噬状况。经Western blot验证,si-BNIP3对BNIP3进行抑制后,能够有效抑制失巢后肝癌细胞中内源性和外源性LC3的剪切。5.3si-BNIP3通过caspase依赖性途径逆转了悬浮培养的肝癌细胞抵抗失巢凋亡的能力对转染si-BNIP3的肝癌细胞进行失巢处理24h后,检测肝癌细胞的生存状况、细胞活力和凋亡水平。经CCK-8和台盼蓝染色检测细胞细胞存活状况,结果显示转染si-BNIP3的悬浮培养的肝癌细胞死亡率明显增加。应用Western blot和Caspase-3/cpp32比色法试剂盒检测Caspase-3的活化,结果显示,转染siBNIP3的肝癌细胞在失巢后,其caspase3的活化水平显著增加。该结果提示,转染si-BNIP3的肝癌细胞通过caspase依赖性途径逆转对失巢凋亡的抵抗效应。结论综上所述,我们成功构建了人BNIP3的真核表达载体pcDNA3.1-BNIP3和shRNA干扰载体pSliencer-BNIP3,发现肝癌细胞中高表达BNIP3可以显著增强自噬,而BNIP3的表达受到抑制时,肝癌细胞自噬明显减少。我们通过构建肝癌转移的细胞模型,动态模拟了肝癌细胞的转移过程。失巢后的肝癌细胞中,BNIP3的表达明显上调,其表达受到ERK/HIF-1α通路的调控。进一步深入探讨其机制显示,BNIP3通过对mTOR通路的抑制增强了悬浮培养的肝癌细胞中的自噬,并进一步介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。简言之,本研究提示,转移性肝癌中ERK/HIF-1a通路的活化使BNIP3的表达上调后,BNIP3通过抑制mTOR通路介导自噬的增强而使肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡的能力。对BNIP3在悬浮培养的肝癌细胞抵抗失巢凋亡的功能和分子机制的研究,将有助于建立靶向BNIP3的新疗法以预防和治疗肝癌转移。创新点1本研究率先报道人BNIP3真核表达载体和shRNA表达载体的成功构建。并且从正反两面证明了BNIP3能够介导肝癌细胞中的自噬。2本研究利用肝癌转移的细胞模型,成功模拟了肝癌在体内从原发灶转移到继发灶的侵袭、迁徙和转移过程。3本研究证明了抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的高表达,并且首次发现抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的表达受到ERK/HIF-1α通路的调控。4本研究证明了在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中自噬增强,并首次利用RNAi技术证明了BNIP3对mTOR通路的抑制调控抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的自噬。5本研究发现抵抗失巢凋亡的肝癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制,ERK/HIF-1α活化后高表达BNIP3,抑制mTOR通路增强自噬,从而使肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡的能力,提示我们以BNIP3为靶标开发新的药物诊断和治疗肝癌转移。