论文部分内容阅读
背景与目的： 葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是热休克蛋白家族成员之一,是内质网中的分子伴侣。GRP78是未折叠蛋白反应(UPR)中的主要调节剂,能阻止压力性传感器的活化、维护胞内钙离子稳态、结合促凋亡分子,从而减少细胞程序性死亡。GRP78在缺氧、低血糖、酸化等微环境应激条件引起的压力性应激中起着重要的作用。近来有研究提示氧化应激以及血清剥夺等微环境应激条件与内质网压力性应激反应有着密切的关系。课题组前期工作证明,增加糖调节蛋白78(GRP78)在胰岛β细胞的表达不仅可以保护胰岛β细胞抵抗STZ诱导的凋亡,同时还可诱导免疫负调 T细胞的形成,参与免疫调节,但其机制尚不清楚。本实验构建人GRP78的真核表达质粒,以及建立稳定表达人GRP78的细胞系CHO-GRP78,研究氧化应激、血清剥夺条件下,过表达的GRP78对CHO细胞凋亡以及存活率的影响,为进一步研究其在细胞凋亡以及免疫调节中的作用奠定基础。 方法： 1.pIRES2-EGFP真核表达载体的构建 运用RT-PCR从胃癌细胞AGS中获得人GRP78目的基因,以BamHⅠ为多克隆位点克隆至pIRES2-EGFP真核表达载体。 2.稳定表达pIRES2-EGFP/GRP78的CHO细胞系的建立 用LipofectamineTM2000将pIRES2-EGFP/GRP78质粒转染至CHO细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞系,命名为CHO-GRP78。 3.CHO-GRP78细胞中GRP78表达的鉴定 通过RT-PCR检测GRP78 mRNA的表达。采用western blot检测GRP78蛋白的表达;采用共聚焦显微镜和流式细胞术检测GRP78蛋白的表达和分布。 4.细胞凋亡检测 收集血清剥夺24h、48h的细胞,Annexin-APC和PI染色,FCM检测细胞的凋亡。 5.MTT法测细胞存活率 细胞接种于96孔板培养24h,无血清培养24h使细胞同步化,然后以浓度为200μM、400μM、500μM、600μM的H2O2处理细胞4h诱导细胞凋亡。加入MTT培养4h,用490nm的波长进行检测。 结果： 1.酶切鉴定以及DNA序列分析结果显示 GRP78克隆以及PIRES2-EGFP/GRP78表达载体构建成功。 2.RT-PCR结果显示CHO-GRP78中GRP78 mRNA表达水平高于CHO细胞;western blot显示CHO-GRP78细胞总蛋白以及上清中GRP78蛋白的表达量高于CHO细胞,且CHO-GRP78中GRP78蛋白表达的阳性率以及平均荧光强度均高于CHO细胞;共聚焦显微镜、流式细胞术检测显示GRP78主要定位于胞浆以及胞核中。 3.GRP78功能检测 (1)过表达 GRP78对血清剥夺诱导的CHO细胞凋亡的影响:CHO、CHO-GRP78无血清培养基培养24h、48h后检测细胞凋亡,结果显示,24h、48h时CHO-GRP78细胞存活率均高于CHO细胞,48h时CHO-GRP78的损伤率低于CHO细胞。 (2)过表达GRP78对不同浓度H2O2作用下CHO细胞存活率的影响:结果显示在200μM、400μM、500μM的H2O2作用下 CHO-GRP78细胞存活率高于CHO细胞,在双氧水浓度为400μM时差异性最为显著;并且在一定范围内随着H2O2浓度的升高,细胞的存活率呈梯度性下降。 结论： pIRES2-EGFP/GRP78真核表达载体构建成功,并且在CHO细胞中获得高表达,过表达的GRP78主要定位于胞浆、胞核中亦可分泌至上清中。GRP78可以保护CHO抵抗血清剥夺及H2O2引起的损伤作用,进一步证明GRP78与氧化应激以及血清剥夺诱导的凋亡存在密切的关系。