口腔黏膜和覆盖于体表的皮肤由表皮和真皮组成，并借助皮下组织与深部组织相连，处于最外层的表皮属于复层鳞状上皮。表皮终生处于增殖、分化及脱落的不断更新之中，这是由于其中的表皮干细胞不断增殖分化所致，且表皮干细胞的增殖分化与外层终末分化细胞的不断脱落保持动态平衡，而这种平衡是维持口腔黏膜和皮肤正常组织结构和细胞内环境稳定的基本条件。目前较统一的观点认为表皮干细胞是一种在体内具有无限更新能力，且可分化形成全层表皮的细胞，在体外培养具有长期生长潜能，并可形成克隆。随着发育生物学的发展，研究者发现表皮干细胞在受损皮肤功能与结构重建中也具有重要作用。而各种原因所致皮肤缺损的修复是临床常见问题，近年来，随着组织工程技术的发展，研制人工皮肤替代物成为研究热点，但存在种子细胞增殖的有限性等问题。如果能在体外成功培养表皮干细胞，对于组织工程皮肤种子细胞的研究也极有意义。另外，由于表皮干细胞在机体中终身存在，因而成为遗传性皮肤病的基因治疗的靶向细胞，并且相关的研究涉及到各个方面。 本研究在体外成功筛选、培养出表皮干细胞，并将其应用于全层组织工程皮肤的构建。实验主要包括以下内容： 1．表皮干细胞在成人及胎儿不同部位皮肤中分布的比较：检测表皮干细胞相对特异性分子—角蛋白19(cytokeratin 19，Ck19)及整合素β1在胎儿及成人不同部位皮肤中的表达，比较表皮干细胞在成人及胎儿皮肤中分布的差异，并进行定位。结果表明表皮干细胞分布于人类皮肤的表皮基底 第四军匠大学硕士学位论文层及部分毛囊细胞中，在胎儿皮肤中该细胞数量比成人多，说明该类细胞随年龄逐渐减少的生物学改变，也反映了皮肤的生理性变化。 2．角肮细胞长期培养过程中角蛋白19表达的分析研究：分析实验室条件下人角肮细胞长期体外培养过程中有无表皮干细胞的存在，观察角肮细胞体外的生长过程。所用的组织分离方法可得到包括表皮干细胞在内的几乎全部数目的表皮基底层细胞，为进行表皮干细胞的分离及筛选奠定实验基础。 3．人表皮干细胞体外筛选及鉴定的实验研究：探讨体外筛选及鉴定表皮干细胞的方法。利用ESC对胞外基质的快速劲附性，选择不同时间点虱附的细胞分为三组（5。in、20。in、60 min组），并以不进行筛选的细胞作对照组。体外培养扩增后，以ESC的相对特异性标识分子pl整合素、Cklg的单克隆抗体，用免疫组化方法对各组细胞进行鉴定，利用图像分析系统测其平均灰度值，进行统计学分析。并用透射电镜对各组细胞检测。结果表明利用胞外基质筛选的5 min组细胞处于幼稚状态，并有强的克隆形成能力，符合预期的ESC特点。因而，可以利用ESC对胞外基质的快速瓢附性对其纯化筛选，同时利用pl整合素及Ck19单抗加以鉴定。 4．表皮干细胞在不同培养基中生长状态的观察研究：配制FAD、FAD卜X FADZ什＊ FAD3什X KSFM等 5种不同的培养基，同时应用同一个体的成纤维细胞经丝裂霉素处理后作滋养层，培养人表皮干细胞，通过细胞曲线、MTT检测观察细胞的生长状态。结果显示细胞在FAD组中生长良好，而加入bFGF可以进一步改善细胞的生长状态。 5．表皮千细胞生物学性状的初步探讨：在体外培养扩增表皮干细胞后，利用透射电镜、流式细胞仪分析、BrdU检测观察细胞的生长状态，结合流式细胞仪分析来观察细胞的周期变化。结果表明表皮干细胞在体外培养过程中，呈典型的克隆性生长；在稳定状态下是一种处于静止期的幼稚细胞，大部分处于 G。／G；期。 3 第四军医大学硕士一位论文 6．表皮干细胞在构建组织工程皮肤中的应用：用表皮干细胞和同一个体的真皮成纤维细胞构建组织工程皮肤。分为3组，一组单纯利用表皮干细胞；一组表皮干细胞和未经筛选的角肮细胞按一定比例混合；同时单纯用角肮细胞作为对照组。通过HE染色、免疫组织化学方法对组织工程皮肤进行检测，观察构建皮肤的异同。结果显示利用表皮干细胞可形成全层表皮，且仍有大量表皮干细胞的存在，形成基底层；利用混合细胞，构建的皮肤中表皮层明显多于其它组，且有基底层的形成，效果较好。