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背景第二代抗精神病药物(Second generation antipsychotics drugs,SGA)是治疗精神分裂症最常见的药物,与第一代抗精神病药物相比有很大的优势[1,2]。这些药物也越来越多地运用到其他精神疾病的治疗上,如精神障碍、孤独症及抑郁症等[3,4,5]。然而,在临床应用中,SGA主要的副作用是体重增加和代谢异常,包括高血糖、胰岛素耐受、Ⅱ型糖尿病、血脂异常和心血管疾病等[6,7]。骨髓间充质干细胞是一种颇具潜力的基因工程细胞,在体外能够诱导分化为脂肪细胞,是体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。关于SGA对小鼠骨髓间充质干细胞的作用研究较少。SGA引起体重增加的机制研究可以帮助指导临床用药及新的治疗方法的设计,以减少这些药物的副作用。目的1.探讨奥氮平和氯氮平对小鼠BMSCs增殖、成脂分化的影响;2.探究奥氮平和氯氮平在BMSCs增殖、成脂分化中的作用机制,为SGA可能导致肥胖及糖尿病的发生机制提供理论依据。方法1.细胞培养:BMSCs采用低糖DMEM+10%FBS进行培养,当细胞融合达到80-90%时,按照1:2或者1:3的比例进行传代。2.细胞诱导:(1)成脂诱导:用含有10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX、1.0μmol/L地塞米松、10%胎牛血清的DMEM低糖培养基(即成脂培养基)培养细胞2 d,随后换成含有10 mg/L胰岛素、10%胎牛血清的DMEM低糖培养基,每2 d换一次液直到细胞分化成熟;(2)加入一定浓度的第二代抗精神病药物诱导。(3)成脂培养基与药物同时加入BMSCs进行诱导。3.采用MTT比色法和细胞计数法测定不同浓度的奥氮平、氯氮平对细胞增殖的影响,选取适宜浓度的奥氮平进行随后的实验。4.采用油红O染色、Western bloting、q RT-PCR等方法检测奥氮平对细胞成脂分化的作用及相关机制。结果1.MTT比色法和细胞计数法实验结果显示高浓度(80μM和100μM)奥氮平和氯氮平显著抑制细胞生长,20μM奥氮平和20μM氯氮平对BMSCs的的增殖几乎没有影响;2.油红O染色可见加入奥氮平的实验组细胞内脂肪滴明显多于阴性对照组;而MDI(成脂培养基)+奥氮平组、MDI+氯氮平组细胞内脂肪滴较MDI组(阳性对照组)有明显减少。3.Western blot结果显示:单独使用奥氮平时,脂肪分化标志基因αp2和C/EBPβ的蛋白表达水平与对照组相比分别上升了36%(P<0.01)、25%(P<0.05),均具有统计学意义;单独使用氯氮平时,C/EBPβ和αP2蛋白质表达水平分别上升35%(P<0.01)、25%(P>0.05),前者具统计学意义,后者差异不显著,无统计学意义;MDI和奥氮平共同作用时,MDI+20μM奥氮平组C/EBPβ和αP2的蛋白表达水平都比MDI组有所降低,灰度值分析表明降低水平差异性显著,具有统计学意义;MDI和氯氮平共同作用时,MDI+20μM氯氮平组C/EBPβ和αP2的蛋白质表达水平也较MDI组明显降低。4.RT-q PCR结果显示:单独使用奥氮平时,成脂相关基因Leptin、C/EBPα和Tnf-α的表达水平较对照组显著升高,分别上升68%(P<0.001)、79%(P<0.01)和60%(P<0.01);单独使用氯氮平时,成脂相关基因PPARγ、Leptin和Tnf-α的m RNA表达水平分别上升52%(P<0.01)、66%(P<0.05)、65%(P<0.05),均具有统计学意义;MDI和奥氮平共同作用时,Leptin和C/EBPα的m RNA表达水平较MDI组显著降低,分别下调了65%(P<0.01)、84%(P<0.05),均具有统计学意义;MDI和氯氮平共同作用时,MDI+奥氮平组Leptin的m RNA表达水平较MDI组显著降低,下调了50%(P<0.001),具统计学意义;而PPARγ的基因表达水平有所升高;脂肪分化的负调控因子Tnf-α的m RNA表达水平较对照组和MDI组都有所上升,且具有统计学意义。5.Western blot检测结果显示:单独使用奥氮平时,p-Akt的含量明显高于对照组、p-GSK-3β的表达随着p-Akt表达的增加逐渐减少,加入PI3K/Akt特异性阻断剂(LY294002)后αp2和C/EBPβ的表达受到抑制,油红O染色结果显示细胞中的脂肪滴也明显减少;MDI和奥氮平共同作用时,下调了p-Akt的表达,而其上下游p-IRS和p-GSK-3β的表达也有变化。其中,p-Akt和p-IRS的表达较MDI组有所下调,且随着浓度的增加,逐渐下调。结论1.单独使用奥氮平、氯氮平可以促进小鼠BMSCs的成脂分化,且奥氮平的促进作用明显强于氯氮平;奥氮平可能通过促使PI3K/Akt信号通路中Akt磷酸化水平的升高来促进小鼠BMSCs的脂肪分化。2.MDI分别与奥氮平、氯氮平共同作用,与单独使用MDI相比,抑制了小鼠BMSCs的成脂分化。MDI和奥氮平共同作用时,胰岛素信号通路受到抑制,可能引起胰岛素耐受,其具体的机制有待于进一步研究。