随着经济发展及人民生活水平的提高,高血压已成为危害人类健康的常见病、多发病。由于周身动脉的强烈收缩,导致人体血压升高,最终引起心、脑、肾等多个脏器功能障碍。高血压所致的脑血管损害即是高血压病的并发症之一。尽管近年来关于高血压脑损害的发生机制有了些突破性进展。但迄今为止,其确切发病机制尚不明了。众所周知,长期高血压可引起全身小动脉病变,表现为小动脉中层平滑肌细胞增殖和纤维化,管壁增厚和管腔狭窄,其一方面促使脑动脉粥样硬化和脑血栓形成,另一方面,因血管腔狭窄,使脑血管发生缺血与变性,容易形成微动脉瘤,从而发生脑出血。这些病理生理改变的最终结果是脑组织萎缩或功能退化,其过程酷似人类器官功能衰老退化的过程。为了研究高血压脑损害的发生机制并探讨高血压脑损害是否与衰老相关基因(Klotho基因)或某些危险因素相关,本组研究通过动物实验和临床研究两部分进行。第一部分(动物实验):Klotho基因在自发性高血压模型鼠脑组织中的表达及药物干预实验目的以自发性高血压(SHR)模型鼠作为研究对象,观察高血压模型鼠脑组织损害的超微结构变化和Klotho基因、微炎症因子在脑组织中的表达状况及用福辛普利(Fosinopril,简称Fos)、缬沙坦(Valsartan,简称Val)与二者联合干预后其脑组织中抗衰老基因Klotho基因和微炎症因子细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,简称ICAM-1)和血管细胞间粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,简称VCAM-1)的表达变化,探讨Klotho基因及微炎症因子在高血压脑损害中的作用与地位并探寻高血压脑损害的早期有效治疗方法。方法20只雄性SHR鼠(22周龄)随机分为4组:高血压组(SHR组,蒸馏水灌胃);Fos组(Fosinopril干预,以Fos10mg/kg/d灌胃);Val组(Valsartan干预,以Val 50mg/kg/d灌胃);Fos+Val组,(Fosinopril与Valsartan联合干预,以Fos 10mg/kg/d+Val 50mg/kg/d联合灌胃),每组5只。WKY组:5只Wistar-kyoto大鼠,作为正常对照组,蒸馏水灌胃。各组大鼠自由进食、饮水,共喂养8周至30周龄。实验过程中,①观察药物干预前、后SHR模型鼠高血压和体重的变化;②用电镜观察高血压脑损害时脑细胞的超微结构变化及Fos、Val药物干预对SHR模型鼠脑神经元结构的影响;③用RT-PCR、Western bolt和免疫组织化学法分别检测SHR模型鼠脑组织中Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白质的表达水平并观察Fos、Val干预实验后的表达变化。结果1.药物干预对SHR模型鼠血压、体重的影响药物干预前,SHR组的大鼠血压均明显高于正常对照组(WKY组)(p＜0.01);经药物Fos、Val以及两者联合干预8周后,大鼠血压跟干预前比较明显降低(p＜0.01)。药物干预前、后5组间大鼠体重没有明显差异(p＞0.05)。提示药物Fos、Val以及两者联合干预能降低SHR大鼠的血压,抑制高血压的进程(p＜0.05)。2.SHR模型鼠脑组织超微结构的变化及药物干预对其的影响药物干预8周后,取药物干预组和对照组大脑组织,电镜检测结果:(1)WKY组:神经元细胞形态结构基本正常,胞浆内粗面内质网及游离核糖体丰富,结构清晰,核大而圆,核膜清晰,核仁明显,核染色质浅淡。(2)SHR组:约半数神经元细胞呈不同程度凋亡改变,表现为细胞固缩,染色质边集,核开始碎裂,凋亡小体形成。(3)Fos组:少数神经元细胞核固缩,染色质边集,绝大多数神经元细胞形态结构基本正常。(4)VAL组:部分神经元细胞核固缩、扭曲、碎裂,有部分神经元扭曲变形,早期凋亡小体开始。(5)Fos+Val组:大多数神经元细胞趋于正常,胞浆内粗面内质网及游离核糖体结构清晰,亦有少数神经元细胞核固缩,染色质边集,核开始碎裂。凋亡改变组间比较发现:由多到少排列:SHR组→Val组→Fos组→Fos+Val组→正常组(WKY组)。提示高血压可损害脑神经元细胞的结构,经Fos、Val以及两药联合干预后,其神经元损害有不同程度的恢复或减缓,证明Fos、Val具有保护脑细胞功能的作用。3.Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1在自发性高血压大鼠脑组织中的表达及药物干预作用(1)RT-PCR和Western blot检测SHR鼠脑组织药物干预前后Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白水平的表达变化A.Klotho基因表达变化情况:①与正常对照组相比,SHR组脑组织Klotho基因表达明显下调;②药物干预8周后,Fos组、Val组和Fos与Val联合干预组的Klotho基因的表达与正常对照(WKY)组比较无明显差异(p＞0.05),而与SHR组比较显著上调(p＜0.05)。B.ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达变化情况:①SHR组脑组织ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达与正常对照(WKY)组比明显上调(p＜0.01);②药物干预8周后,Fos组、Val组和Fos与Val联合干预组ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达与正常对照(WKY)组相比没有明显的差异(p＞0.05),与自发性高血压(SHR组)比较存在明显的差异(均为p＜0.01)。结果表明:SHR组脑组织ICAM-1和VCAM-1 mRNA处于高表达状况,而用Fos、Val或Fos与Val联合干预可以使SHR模型鼠脑组织的ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达水平下调(p＜0.05及p＜0.01)。(2)免疫组织化学法检测SHR组脑组织药物干预前后Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1在蛋白水平的表达变化A.Klotho蛋白主要表达于神经元细胞的胞浆中。①WKY组Klotho蛋白有少量表达,②与WKY组比较,SHR组神经元细胞中的表达明显减少(p＜0.05),③药物干预8周后,与WKY组比较,Fos组、Val组和Fos+Val组Klotho蛋白表达差异无统计学意义(p＞0.05);与SHR组比较,Klotho蛋白表达显著增强(p＜0.05)。B.ICAM-1和VCAM-1蛋白主要表达于血管内皮及外膜、神经元细胞、胶质细胞,细胞间质亦有部分表达。①WKY组ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量极少,②与WKY组比较,SHR组神经元细胞中的表达显著上调(p＜0.05),③药物(Fos、Val或Fos+Val)干预8周后,与WKY组比较,Fos组、Val组和Fos+Val组ICAM-1和VCAM-1蛋白表达差异无统计学意义(p＞0.05);与SHR组比较,ICAM-1和VCAM-1蛋白表达显著下调(p＜0.05)。小结1.高血压可导致脑组织损害;2.高血压脑损害时脑组织Klotho基因处于低表达水平,而微炎症因子ICAM-1、VCAM-1呈现高表达;3.Fos或/和Val除了有效降压,同时还能通过调控Klotho基因、ICAM-1和VCAM-1表达状况来保护细胞功能;4.高血压脑损伤有炎症因子参与,且可能与抗衰老基因Klotho基因有一定的关系;5.使用福辛普利或缬沙坦可能有利于早期防治高血压脑损害。第二部分(临床研究):高血压脑损害患者血清Klotho蛋白水平测定及相关危险因素分析目的在本组研究的动物实验研究基础上,拟从临床研究角度检测高血压脑损害患者血浆Klotho蛋白水平的变化,并针对高血压发生的相关危险因素(包括年龄、血压、血糖、胆固醇及高血压病史)进行综合分析,旨在进一步探讨高血压脑损害的发病机制及相关的危险因素,为今后高血压脑损害的早期防治提供依据。方法以湘雅医院2007年9月2008年3月门急诊患者为研究对象(确诊的未出现并发症的高血压患者56例,高血压脑损害患者104例),以正常血压人群30例作对照,检测三组研究对象血清Klotho蛋白浓度与血清胆固醇、肌酐、血糖、血压水平并针对以上因素及年龄和高血压病史等危险因素进行相关性分析。结果正常对照组血清Klotho蛋白浓度明显高于高血压(无脑损害)组与高血压脑损害组(p＜0.05),同时高血压(无脑损害)组明显高于高血压脑损害组(p＜0.05)。血清Klotho蛋白浓度与高血压及高血压脑损害患者的胆固醇、肌酐、血糖、血压、年龄以及高血压病史等均存在负相关。小结1.血清Klotho蛋白浓度随血压升高的程度而呈逐渐下降的趋势;2.血清Klotho蛋白浓度与高血压及高血压脑损害患者的胆固醇、肌酐、血糖、血压、年龄以及高血压病史等均存在负相关,胆固醇、肌酐、血糖、血压等越高、年龄越大以及高血压病史等越长,血清Klotho蛋白浓度越低;3.血清Klotho蛋白浓度增加可能是高血压及高血压脑损害的保护性因素;4.高血压患者定期检测血清Klotho蛋白浓度可能有助于早期监测高血压脑损害。结论1.SHR模型鼠在血压升高的同时存在脑组织损害,即电镜中可观察到的高血压模型鼠脑组织凋亡小体的形成;2.SHR模型鼠脑组织有ICAM与VCAM的mRNA与蛋白质表达水平上调,证明高血压脑损害时存在血管炎症改变;3.SHR模型鼠在炎症改变同时,其脑组织Klotho基因表达下调,说明高血压脑损害可能与衰老过程有关;4.福辛普利和缬沙坦干预实验后,脑组织炎症改变(ICAM-1、VCAM-1 mRNA与蛋白质表达水平下调)好转同时Kloth基因表达上调。提示福辛普利和缬沙坦对高血压脑组织的保护除了降压作用外,可能还与改变Klotho基因表达有关;5.临床研究结果表明,高血压患者血清Klotho蛋白水平较正常人低,且与胆固醇、肌酐、血糖、血压、年龄以及高血压病史等均存在负相关,胆固醇、肌酐、血糖、血压等越高、年龄越大以及高血压病史等越长,血清Klotho浓度越低,提示高血压患者定期检测血清Klotho蛋白水平可能对早期监测高血压脑损害有着重要意义。