产尿酸氧化酶菌株筛选及在家禽高尿酸血症中的应用研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kkfhvk1
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高尿酸血症(Hyperuricemia,HUA)是一种以血清尿酸水平异常升高为特征的疾病,其典型损害包括炎症、氧化应激和肠道生物失调等。由于尿酸氧化酶基因的错义突变,灵长类和鸟类动物血清尿酸水平高于其他动物,因而更容易发生高尿酸血症。为了缓解和治疗家禽高尿酸血症,本研究拟筛选出产尿酸氧化酶高活性菌株,通过饲料添加饲喂,降低肠道中尿酸浓度,增加肠道尿酸分泌、减少肠道尿酸重吸收,从而达到预防和治疗家禽HUA的目的,主要研究结果如下:1.基于产尿酸氧化酶菌株能在尿酸筛选培养基上产生尿酸氧化酶透明圈,共筛选出56株产尿酸氧化酶透明圈,通过形态学观察,可将筛选菌株分为7大类;通过镜检观察结果,可将筛选菌株分为4大类。筛选菌株产尿酸酶的能力通过H/C值(透明圈直径/菌落直径)来评定,H/C值越大说明产酶能力较强,结果显示,H/C值的范围在1.20±0.01-7.75±0.25,其中HC值超过4.00的菌株有13株,2.00<HC<4.00的菌株有12株,其余的31株菌株H/C小于2.00。采用平板点种法测定了所筛选菌株的酶活性(蛋白酶和淀粉酶),结果显示,筛选菌株中只有菌株d36具有产蛋白酶能力;菌株d26、d24、d18、d44、d33、c7、c4具备产淀粉酶能力。2.通过NCBI网站对测序结果进行的同源性对比显示,在已鉴定的27株菌株中,15株属于产碱杆菌属。利用MEGA.7.0软件构建了菌株AS1和菌株P56的系统发育树,结果显示,菌株AS1与粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)同源性最高,菌株P56与瓜里科假单胞菌(Pseudomonas guariconensis)同源性最高。通过测定菌悬液的OD600来反应菌株的生长特性。结果显示,菌株AS1在10h时达到对数期,在24h时进入平台期;菌株P56在4h后可到对数期,在20h后进入平台期。3.采用腺嘌呤、尿酸,以及乙胺丁醇辅助,通过肠道给药构建高尿酸血症模型,根据血清尿酸和肌酐浓度筛选造模药物和剂量。结果显示,高尿酸血症造模给药第5d,高腺嘌呤联合乙胺丁醇组(AE-H组)血清尿酸浓度与空白对照组相比,呈升高趋势,AE-H组在所有组中呈现出最高的血清尿酸浓度。第9d时,这一趋势更加明显。为优化腺嘌呤给药剂量,设置腺嘌呤系列给药浓度(550、650、750、850、950mg/kg B.W),并联合乙胺丁醇(125mg/kg B.W)给药。结果显示,在4d时,腺嘌呤550mg/kg B.W给药组血清尿酸浓度与对照组比较无显著差异;650mg/kg B.W给药组血清尿酸浓度显著升高(p<0.05);750、850和950mg/kg B.W给药组血清UA浓度显著升高(p<0.01),后两个高剂量组在第4d出现死亡,因此后续实验采用750mg/kg B.W.的给药剂量来构建鸭高尿酸血症模型。4.试验菌株AS1和P56对健康鸭子的安全性观察试验显示,菌株AS1和P56试验菌株不具备致病性,对鸭的健康无负面影响。试验菌株降低高尿酸血症鸭血清尿酸浓度的试验结果显示,在4d时,造模期间同时拌料给饲AS1菌株,与模型组可显著降低血清尿酸浓度;同时拌料给饲菌株P56,血清尿酸浓度无显著差异。通过前期的试验,确定AS1为高效菌株,因此探究其对高尿酸血症鸭的治疗效果。CON组用5%CMC-Na胶体溶液灌胃,AE组和AE-AS1组用腺嘌呤(750mg/kg B.W)+乙胺丁醇(125mg/kg B.W)灌胃给药;CON组和AE组饲喂正常饲料,AE-AS1组饲喂添加AS1菌液饲料,拌料浓度为2.1×10~9CFU/kg,于第4d结束实验。结果显示,AE组和AE-AS1组血清尿酸浓度高于CON,其中AE-AS1组血清尿酸浓度显著低于AE组(p<0.01),AE-AS1组血清BUN和ALT浓度显著低于AE组(p<0.01);AE-AS1和AE组粪便中存在大量的尿酸盐,肾脏组织学切片中也可以观察到存在白色的尿酸盐。由上述结果可知,从鸭粪便中可以筛选出高产尿酸氧化酶的菌株,经鉴定大部分菌株为产碱杆菌,其中一株产碱杆菌AS1通过拌料给饲的方式治疗高尿酸血症鸭子,4d时就可以显著降低其血清UA浓度,且对高尿酸血症引起的肾脏损伤有一定的缓解作用。
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