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目的：探讨G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)超家族成员神经降压素受体1(Neurotensin receptor1，NTR1)和Apelin受体(putative receptor proteinrelated to AT1，APJ)异源二聚体的形成，研究该异源二聚体的形成对细胞内信号转导功能的影响。为NTR1和APJ参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供实验依据。试图为相关疾病发生的分子机制提供资料，本研究有助于探寻相关疾病治疗的新突破点。
方法：⑴人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)体外培养：采用不完全RPMI-1640培养基(含有10％胎牛血清)于37℃，5％CO2培养箱中常规培养HUVECs。⑵HUVECs中NTR1和APJ内源性表达的测定：培养细胞，72h后收集细胞的RNA和蛋白质，应用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和Western blot，分别从基因水平和蛋白质水平上检测HUVECs中NTR1和APJ内源性表达。⑶质粒构建及表达：为研究NTR1与APJ之间是否能够形成异源二聚物，我们拟构建了相应的表达载体。首先，我们用分子克隆方法分别构建了用于BRET的两个真核重组质粒和用于FRET的两个真核重组质粒：pR1uc-hNTR1-pcDNA3.1和pEGFP-hAPJ-pcDNA3.1；pCFP-hNTR1-pcDNA3.1和pYFP-hAPJ-pcDNA3.1。用激光共聚焦和Western blot鉴定重组质粒pR1uc-hNTR1-pcDNA3.1在HEK293细胞中的表达。⑷免疫荧光双标记法初步检测NTR1与APJ在HEK293细胞上的共定位情况：在质粒构建成功的基础上，将两个重组质粒单独或共同转染HEK293细胞，进行免疫荧光染色，并用激光共聚焦显微镜进行观察。⑸生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)检测NTR1与APJ之间是否能够形成异源二聚物：饱和实验，用前期试验构建的pR1uc-hNTR1-pcDNA3.1和pEGFP-hAPJ-pcDNA3.1(按不同的比例)共同转染HEK293细胞，转染48h后加入发光底物进行BRET信号检测；配体诱导实验，我们用APJ的配体apelin-13或/和NTR1的配体神经降压素刺激15min后，再次检测BRET信号。⑹荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)进一步检测NTR1与APJ之间是否能够形成异源二聚物：用前期试验构建的pCFP-hNTR1-pcDNA-3.1和pYFP-hAPJ-pcDNA3.1单独或共同转染HEK293细胞，转染后12-24h，检测FRET信号。⑺Western blot检测ERK1/2磷酸化：为了检测异源二聚物对受体介导的信号转导途径的影响，我们用10-5-10-8mol/L的apelin-13处理HEK293-APJ和HEK293-APJ/N-TR1，用10-5-10-8mol/L的NT处理HEK293-NTR1和HEK293-APJ/NTR1，检测了浓度依赖的ERK磷酸化。
结果：①倒置显微镜观察人脐静脉内皮细胞生长状态良好，镶嵌排列呈“铺路石”样，细胞较大，呈多角形，无重叠生长现象。②通过RT-PCR和Western blot检测发现，无论在基因水平还是蛋白质水平上NTR1和APJ在HUVECs中均有表达。③用于BRET和FRET所构建的质粒通过双酶切实验和上海生工测序鉴定，证实所构建的重组质粒成功。并且激光共聚焦显微镜观察显示，受体在细胞膜表达，定位正确；Western blot显示受体表达成功，可用于进一步的实验。④在质粒构建成功的基础上，将两个重组质粒单独或共同转染HEK293细胞，免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜进行观察，结果显示：两个受体均表达在细胞膜上，并且定位高度一致，二者存在着相互作用。⑤采用BRET技术，在活细胞中实时、动态地研究了二者之间的相互作用。饱和实验结果显示，在Rluc-NTR1和EGFP-APJ共转染组的细胞，随着受体浓度的增加，BRET值逐渐增加，达到一定值的时候，BRET值不会再增加，达到饱和状态，证明二者的结合为特异性结合，并且这种特异性的相互作用是组成型的(constitutive)，即在没有配体刺激时就能够发生。配体结合试验结果显示，用APJ的配体apelin-13或NTR1的配体NT单独刺激15min后，BRET信号明显增强，表明配体的刺激能够增强相互作用的亲和力。⑥采用另一种新的技术即FRET，研究了二者之间的相互作用。pCFP-hNTR1-pcDNA3.1和pYFP-hAPJ-pcDNA3.1单独或共同转染HEK293细胞，转染12-24h后，检测发现，单独转染的细胞均无FRET信号，而共同转染的细胞则有FRET信号，表明NTR1与APJ之间能够形成异源二聚物。以上共定位、BRET和FRET三个实验证实，NTR1与APJ之间能够相互作用，形成异源二聚体。⑦用不同浓度的(10-5-10-8mol/L)NT处理HEK293-NTR1和HEK293-NTR1/APJ细胞15min，用不同浓度的(10-5-10-8mol/L)apelin-13处理HEK293-APJ和HEK293-NTR1/APJ细胞15min。各组细胞均显示浓度依赖性的刺激ERK1/2激活。在NT处理的HEK293-NTR1/APJ细胞中，从10-5-10-8mol/L，ERK磷酸化的值显著高于NT处理的HEK293-NTR1，有趣的是，HEK293-NTR1和EK293-NTR1/APJ达到磷酸化最强的NT浓度分别为10-7和10-8mol/L。在AP的HEK293-NTR1/APJ细胞中，从10-5-10-8mol/L，ERK磷酸化的值显著高于AP的HEK293-APJ的是，HEK293-NTR1和EK293-NTR1/APJ达到磷酸化最强的NT浓度分别为10-6和10-7mol/L。提示，在共转的细胞，ERK激活的敏感性增加。
结论：研究证实，在转染APJ-NTR1的HEK293细胞中，NTR1和APJ能够形成稳定的异源二聚物，经apelin-13或NT诱导后，ERK激活的敏感性增加。本实验对于理解NT和apelin参与的相关生理功能的细胞内分子机制提供了新的实验依据，为相关药物的开发提供了新的可能的作用靶点，具有重要理论意义和实际推广应用价值。