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目的:组织工程构建的移植物其血管网的形成仍是一个难题。本实验旨在探讨完全利用兔原代骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells BMSCs)构建预血管化的移植物,并将该移植物植入裸鼠体内观察是否有功能性血管生成的可行性,从而为工程血管化提供新的构建策略。方法:(1)兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的体外培养及增殖、生长特征观察:运用全骨髓贴壁法分离rBMSCs并培养,传代纯化,在显微镜下观察rBMSCs的生长及增殖。(2)rBMSCs诱导分化为内皮样细胞:将增殖并传代到第2代的rBMSCs在加入10μg/L的血管内皮细胞生长因子(VEGF)和10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)两种细胞因子的诱导液中诱导培养2周,在显微镜下观察细胞形态及增殖、生长特性,利用流式细胞检测技术鉴定诱导分化后的血管内皮样细胞(Endothelial cells ECs)。(3)构建预血管化细胞膜片:将传至第2代的rBMSCs以9×104∕cm2的密度接种至培养皿并培养2周得到未分化膜片,以5×104∕cm2的密度将从rBMSCs诱导得到的ECs均匀接种至形成的未分化膜片上,加入内皮细胞诱导液培养3天,镜下观察细胞的分布及微血管网生成情况。(4)三维预血管化移植物的构建:将在内皮细胞诱导培养液中共培养7天的预血管化膜片(ECs/rBMSCs)用细胞刮刀轻轻刮起,用镊子将膜片折叠三次,形成大约长8mm×宽8mm的三维预血管化细胞膜片结构,作为实验组。将未分化细胞膜片以同样的方法折叠,形成三维的未血管化细胞膜片结构,作为对照组。将折叠后的细胞膜片结构放置内皮细胞诱导培养液中培养24小时,使其成为一个整体。(5)体内实验:将孵育24小时后的两组膜片分别植入裸鼠的背部皮下,并在术后1周、2周两个时间点进行大体观、HE染色及免疫组织化学染色检测。结果:(1)通过全骨髓贴壁法获得了rBMSCs,该细胞在显微镜下的形态呈现梭形、多角形,且以克隆样的方式进行生长;(2)经传代纯化后的rBMSCs在ECs诱导液的诱导下,有向ECs分化的能力,镜下观察到诱导后的ECs呈现出“铺路石样”的细胞形态,细胞表面CD-31阳性表达,流式细胞检测数据结果表明大约有49.40%的细胞CD-31表达呈阳性;(3)按一定的密度将分化后的ECs进行接种,将其至于未分化膜片表面,72h后,镜下可观察到膜片表面有空泡形成;(4)将膜片植入,于术后1周和2周后进行取材,HE染色和CD-31免疫组化染色结果显示,实验组血管生成量均显著多于对照组,且1周和2周实验组的血管生成量并无明显差异;CD-31免疫组化染色结果显示,植入膜片生成的血管可以与宿主血管发生功能性的吻合。结论:完全基于骨髓间充质干细胞可以在体外构建预血管化的细胞膜片,且植入体内后,膜片上预构的毛细血管网可以与宿主血管整合形成功能性血管,为工程化组织血管化提供了新的策略。