研究背景:卵巢癌发病率占妇科恶性肿瘤的46%，因其具有起病隐匿、易转移、复发快、临床治疗效果差、5年生存率低等特点。目前，已经严重威胁妇女生命和健康的[1-2]，其早期诊断和有效治疗已成为临床诊疗的瓶颈。随着逐步对恶性肿瘤侵袭和转移机制的认识，现已证实卵巢癌中有着活跃的血管生成，并对其发生、发展、侵袭、转移及转归等方面起着重要作用。从骨髓、脐血或外周血分离出来的内皮组细胞(endothelial progenitor cell，EPC)能够在趋化因子和生长因子等刺激下募集，归巢于肿瘤血管新生位点，促进微血管床芽生，参与肿瘤血管生成。越来越多的研究证实，EPC在肿瘤新生血管的形成中起着重要的作用，参与肿瘤血管的发生、发展，并促进肿瘤的生长、侵润和转移。并发现由肿瘤分泌的诸如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等生长因子，不仅局部起作用，而且可以动员从骨髓来源的EPC，定居于血管床。在对胰岛素瘤的研究中发现，骨髓来源EPC参与肿瘤新生血管床的生成[3]。在研究胶质瘤中也证实了肿瘤细胞大量分泌VEGF，促进EPC定居于瘤床，并促进其分化参与管道形成的同时，也对肿瘤细胞的自我更新、分化产生一定的影响[4]。在早期肝癌中，骨髓来源的EPC占肿瘤新生血管内皮的6％，而在晚期肝癌中可达27％，并证实在肿瘤血管生成过程中，存在EPC的参与[5]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是参与降解恶性肿瘤细胞外基质和基底膜的关键功能酶之一，能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移。随着国内外研究的进展，人们对HPA认识的深入，发现HPA在卵巢恶性肿瘤组织中的表达明显高于卵巢正常组织，并随肿瘤恶性程度及分期的升高其表达水平呈增高趋势；并证实卵巢癌组织中HPA的表达随着VEGF表达的增强则增高，提示HPA通过释放、激活VEGF来促进肿瘤血管生成。故推测，在恶性肿瘤中，肿瘤细胞与EPC之间构成的微环境可能存在着相互作用，这种作用可能是双向的：微环境中血管性细胞支持癌细胞的分化和更新，而癌细胞同时具有维持微环境细胞的作用。因此在卵巢癌中可能同样存在这种微环境—niches，当有肿瘤细胞释放多种细胞因子，与EPC之间产生相互作用，以促进肿瘤血管生成。鉴于我们在前期试验中已经证实人卵巢癌组织中HPA的表达与肿瘤侵袭、转移、临床分期和微血管密度等有关[6]；且HPA在人卵巢癌skov3细胞中的高表达[7]。此次实验研究针对EPC与卵巢癌细胞之间可能存在一种微环境，卵巢癌细胞分泌的HPA能否促进EPC体外管腔形成这一现象进行研究，并进一步研究其对EPC增值、迁移能力的影响。基于既往研究结果，提出卵巢癌中存在“肿瘤细胞和EPC共处壁龛(tumor cell-endothelial progenitor cell niches，T-E niches)”的假说，推测肿瘤细胞分泌细胞因子或酶与EPC之间相互作用，促进肿瘤血管生成，并促进肿瘤细胞的演进、复发和转移。目的:阐明卵巢癌skov3细胞分泌的HPA对脐血来源的EPC体外管养结构形成及其增值、迁移能力的影响，探讨卵巢癌细胞与EPC之间相互作用的具体机制。方法:1．采用密度梯度离心法分离脐血来源的单核细胞，使用含10％或20％FBS的EGM-2培养基诱导培养至第5-14d，获得较均一、贴壁状态好、生长旺盛的EPC。采用激光共聚焦检测其吞噬DiI-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力(双荧光染色检测)；并采用流式细胞技术检测其细胞表面表达CD34、CD133、VEGFR-2，以此共同鉴定脐血来源的EPC。2．构建HPA-ShRNA慢病毒颗粒转染人卵巢癌skov3细胞，抑制其HPA的表达；并采用real-time PCR、Western blot分别检测卵巢癌细胞分泌HPA的基因和蛋白表达水平，验证阻断效应。并筛选出沉默效果最佳干扰序列的细胞稳定传代后，收集阻断分泌HPA前、后的细胞上清液，采用ELISA检测其中分泌的HPA表达水平。3．将不同体积分数的卵巢癌细胞上清液作用于EPC培养基中，观察不同浓度的HPA对EPC体外管样结构形成、增值及迁移能力的影响。结果:1．早期培养单核细胞形态异质性较大，主要以小圆形为主，其间夹杂大而圆的红细胞。分离的单核细胞接种于包被有人纤维粘连蛋白的培养瓶中，并使用专用培养基诱导培养，静置48h后，将未贴壁的悬浮细胞再次重新接种；3d后贴壁细胞开始伸展成梭形或纺锤形，5-7d后有细胞集落形成，呈梭样铺路石样改变，大约21d后逐步融合成单层内皮细胞。流式细胞仪检测显示，培养第5-14d的EPC均稳定均一的表达VEGFR-2(95.30％)、CD34(47.22％)，CD133(57.29％)，并采用双荧光染色检测，EPC具有吞噬DiI-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力。2．构建HPA-shRNA慢病毒载体，转染人卵巢癌skov3细胞。实验中设计的3对干扰序列存在差异性，其中HPA-shRNA-1和HPA-shRNA-2序列的干扰效果佳；HPA-shRNA-3序列则未达到干扰效果。采用Real-timePCR、Western blot分别检测HPA在基因和蛋白水平方面的表达。结果：shRNA能特异性阻断卵巢癌skov3细胞HPA的表达，并筛选出有效转染的细胞稳定传代。3．不同体积分数卵巢癌细胞上清液作用于EPC培养基中，观察其中不同浓度的HPA对EPC体外管样结构形成、增殖、迁移的影响。证实了卵巢癌细胞分泌的HPA对EPC增值、迁移和管腔形成能力有显著促进作用。结论:1．EPC的成功体外分离，专用培养基诱导培养，第5-14d获得较稳定的EPC。大约3w后融合成单层内皮细胞，失去祖细胞特性。2．构建HPA-shRNA慢病毒载体转染人卵巢癌skov3细胞，有效降低了HPA的表达，获得高效转染。3．不同体积分数卵巢癌细胞上清液作用于EPC培养基中，其中所含的HPA的上清液对EPC体外管样结构形成、增殖及迁移能力有直接的促进作用，这与卵巢癌细胞表面表达HPA有关，提示卵巢癌细胞分泌HPA对EPC增殖、迁移和管样结构形成有直接的促进作用。