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表皮毛是由植物表皮细胞分化形成的一种毛状结构,广泛存在于各种植物器官的表面。根据表皮毛结构不同可以分为单细胞表皮毛或多细胞表皮毛;腺体毛或非腺体毛;分支或不分支。表皮毛作为植物表皮的第一层屏障,可以帮助植物抵御生物逆境和非生物逆境。表皮毛是研究细胞分化和形态发生的经典模式,在拟南芥中得到了广泛研究;番茄中表皮毛的研究较少,调控表皮毛形成的分子机制还不清楚。为了解析调控番茄表皮毛生长发育的遗传基础和分子机制,本研究采用连锁分析和图位克隆的方法分离鉴定了调控表皮毛类型的关键基因Hl-2和Ln,并研究了其功能,预测了番茄表皮毛发育的分子调控模型,主要研究结果如下:1.Hl-2基因影响番茄表皮毛的形态发育,通过图位克隆鉴定该基因并解析了其分子机制。1.1 Hl-2基因的遗传分析及克隆鉴定对无毛突变体3-417和正常有毛材料醋栗番茄LA1589构建的F2分离群体分析发现无毛表型性状由单位点隐性基因控制;利用BSR-seq方法将控制无毛表型的基因初步定位到第2号染色体上,命名为Hairless-2（Hl-2）,进一步将Hl-2精细定位到NH8和NH9两标记间74.7 kb的范围内。根据番茄基因组注释,该区间内包含11个开放阅读框（ORFs）,我们将ORF5作为候选基因。序列分析显示无毛突变体3-417在第658位和659位两个碱基之间插入了一个100 bp的片段,该突变造成了编码区移码突变,氨基酸翻译提前终止。1.2 Hl-2基因的功能验证及表型分析转基因互补实验表明在hl-2突变体中超量表达ORF5能够恢复突变体的表型,在Ailsa Craig中敲除该基因,植株的表皮毛变化明显,呈现无毛表型,表明ORF5即为Hl-2基因。扫描电镜观察发现,突变体hl-2叶片和茎表面的表皮毛形态发生了改变,Ⅰ型腺体毛弯曲、缩短,颈部细胞畸形膨大,正常Ⅰ型腺体毛缺失,表明Hl-2基因在Ⅰ型腺体毛的形成发育中发挥着重要作用。Hl-2基因在各组织中成组成性表达,Hl-2启动子驱动GUS-YFP表达发现,Hl-2在茎尖、茎、叶腋、幼叶和成熟叶均有表达;其中在叶腋、茎尖、幼茎和幼叶基部等幼嫩部位表达量较高。1.3 SlHDZIV8转录因子通过调控Hl-2/Hl的复合体影响表皮毛形态发育酵母双杂交和CO-IP实验表明,Hl-2与Hl互作形成蛋白复合体共同调控Ⅰ型腺体毛的发育。SlHDZIV8是一个HD-zip 的转录因子,其中SlHDZIV8-RNAi植株中叶片的表皮毛密度均降低,表皮毛细胞形态发生改变。Hl-2和Hl在SlHDZIV8-RNAi的转基因系中表达量受到显著抑制,表明SlHDZIV8调控Hl-2和Hl的表达。EMSA和酵母单杂交的结果显示SlHDZIV8通过结合Hl-2的启动子直接调控其表达。1.4 Hl-2影响茎杆机械强度及纤维素含量与对照相比,突变体3-417的茎杆表现出明显的脆性,机械强度降低,茎杆变细,茎杆细胞变小,维管组织变成中空的网状结构,纤维素含量显著降低。参与次生细胞壁合成的相关基因CESA4,CESA7和CESA8的相对表达量在突变体中显著降低。2.Ln基因是番茄中促进表皮毛形成的一个多毛基因,该基因的克隆鉴定在揭示多细胞表皮毛形成的分子机制中具有重要作用。2.1 Ln基因的图位克隆及功能验证以Ln突变体LA3127为母本,LA1589为父本,构建了 F2遗传分离群体,对Ln进行定位。遗传分析发现,突变体的多毛性状是受一个显性核基因调控。采用图位克隆的方法将Ln定位于3号染色体的LMP-12和LM-5两分子标记之间136 kb的范围内。根据番茄基因组注释,该区间内包含14个开放阅读框（ORFs）,我们将ORF7作为候选基因。序列比对发现,突变体LA3127扩增的全长cDNA中发生了单碱基的突变,突变由胞嘧啶（C-1676）变成了腺嘌呤（A）,导致了丙氨酸（Ala-559）到谷氨酸（Glu）的转变。Ln编码一个HD-zip IV的转录因子,定位于细胞核。Ln在根、茎、茎表皮、叶、花、果等不同组织中的表达量分析显示,该基因在各个组织中均有表达,在叶中表达较高。转基因互补实验表明ORF7即为Ln.2.2 Ln与Wo互作促进表皮毛的起始遗传分析发现Wo与Ln之间存在遗传互作,两者之间具有累加效应。酵母双杂交、双分子荧光互补实验（BiFC）和体内蛋白质结合实验显示Wo与Ln之间存在互作,能够形成蛋白复合体,共同促进表皮毛的起始,调控Ⅰ型腺体毛的形成。2.3 H与Ln互作且受促Ln调控影响Ⅰ型腺体毛的形成遗传分析发现Ln与H之间存在遗传互作,双突变体（LnLnhh）和h突变体Ⅰ型腺体毛缺失,表明h对Ln具有隐性上位性。在突变体LA3172中,Ln基因的表达量没有发生变化,在Ln突变体LA3127中H基因表达量升高,在Ln敲除材料中H表达量下降,表明Ln正调控H基因的表达。EMSA和酵母单杂交的结果显示Ln通过结合H的启动子直接调控H的转录。酵母双杂交和双分子荧光互补实验（BiFC）的结果显示Ln与H之间也存在蛋白互作。总结,通过图位克隆分离鉴定了Hl-2和Ln基因,解析了调控番茄表皮毛生长发育的分子遗传基础。实验表明H1-2与H1互作并受SlHDZIV8的调控共同影响番茄表皮毛的形态发育,确立了Hl-2在番茄组织机械性能中的作用。明确了调控Ⅰ型表皮毛形成的基因Ln与Wo和H及之间的遗传和分子互作关系。