【摘 要】
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骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种来源于中胚层的成体干细胞,由于其具有多向分化潜能,免疫调控能力,在细胞、组织工程以及再生医学等方面具有极大的潜力。维生素A（Vitamin A,VA）作为机体不可或缺的一种脂溶性维生素,在动物繁殖、胚胎发育、骨骼发育、机体免疫、抗氧化等方面都具有重要的作用。目前许多体内外试验已经证实VA是一种
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骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是一种来源于中胚层的成体干细胞,由于其具有多向分化潜能,免疫调控能力,在细胞、组织工程以及再生医学等方面具有极大的潜力。维生素A（Vitamin A,VA）作为机体不可或缺的一种脂溶性维生素,在动物繁殖、胚胎发育、骨骼发育、机体免疫、抗氧化等方面都具有重要的作用。目前许多体内外试验已经证实VA是一种有效的抗氧化剂,且具有促进BMSCs增殖和维持干细胞干性的作用。本文旨在探究VA在体外培养犬BMSCs的增殖、衰老、凋亡、免疫相关的作用以及探讨VA对过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导的犬BMSCs氧化损伤的影响。试验一VA对犬BMSCs增殖、衰老、凋亡、免疫方面的影响试验从犬骨髓中分离犬BMSCs,研究了不同浓度（0.5、1、2、4、8、16、32μmol/L）VA预培养对犬BMSCs增殖、衰老、凋亡、免疫方面的影响,为后续抗氧化研究提供理论基础,本试验在VA预处理犬BMSCs 24、48h后,CCK-8法检测其细胞活力,计算细胞存活率;β-半乳糖苷酶染色并计算衰老比例;RT-qPCR检测增殖、衰老、凋亡、免疫相关基因的表达。试验结果如下:VA通过上调增殖基因PCNA、CCND1、Nanog,下调P27达到促进犬BMSCs增殖的作用,且随着VA浓度的增加,细胞存活率以及增殖基因mRNA相对表达量均增加,其中8μmol/L、16μmol/L和32μmol/L具有显著性差异;VA浓度在16μmol/L以下时不具有诱导犬BMSCs衰老及凋亡的毒性作用,但32μmol/LVA会促进其衰老基因P16、P53,凋亡基因Bax基因的表达。VA促进犬BMSCs中免疫相关基因IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β1、VEGF、CXCL12 mRNA相对表达量的提高,促进BMSCs发挥免疫调节作用。试验二VA对H2O2诱导的犬BMSCs氧化损伤模型的影响本试验通过建立犬BMSCs氧化损伤模型,探究VA预处理对犬BMSCs氧化损伤模型的保护作用。首先选用100-1800μmol/L H2O2分别处理犬BMSC细胞2h、6h、18h,通过CCK-8法,β-半乳糖苷酶衰老染色,筛选出1300μmol/L H2O2处理2h组建立氧化损伤模型;随后0.5、1、2、4、8、16、32μmol/LVA预处理24h、48h后,添加1300μmol/L H2O2处理2h,CCK-8法检测细胞活力,β-半乳糖苷酶衰老染色,筛选出16μmol/LVA浓度做后续实验;后续实验分为四组（16μmol/LVA单独预处理24h组;16μmol/LVA预处理24h+1300μmol/L H2O2处理2h组;1300μmol/L H2O2处理2h组;不做处理对照组）,CCK-8法检测细胞活力,β-半乳糖苷酶衰老染色,细胞凋亡与坏死染色计算其凋亡率与坏死率,抗氧化指标SOD、MDA、GSH-Px、CAT含量检测;RT-q PCR检测其衰老、凋亡基因以及抗氧化相关基因的表达。结果显示:4、8、16、32μmol/L VA预处理24h能显著增加H2O2诱导的犬BMSC细胞氧化损伤模型的存活率,降低其衰老比例;其中,16μmol/L VA能通过降低犬BMSCs氧化损伤模型细胞衰老比例以及P16基因相对表达量、降低细胞坏死率以及凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase8相对表达量,提高抗凋亡基因Bcl-2表达量,同时能提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px含量,降低MDA含量;VA能激活抗氧化转录因子Nrf2,促进下游Ⅱ相解毒酶GCLM、NQO1、GPx1、Trx R1基因转录,共同作用起到抗氧化效果。结论:8-32μmol/L VA具有促进犬BMSCs增殖的作用并且能促进其免疫相关基因表达;16μmol/L VA通过激活Nrf2信号通路对H2O2诱导的犬BMSCs氧化损伤具有保护作用。
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