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猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis virus of swine,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis vires of swine,TGEV)引起的一种高度接触性肠道传染病,临床症状主要表现为发病仔猪严重腹泻、呕吐和脱水,该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。本研究以TEGV重组N蛋白为免疫抗原,成功制备了抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体,对TGE的诊断、预防和控制具有较大的意义。1、TGEV重组N蛋白的制备、纯化与鉴定将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因重组表达质粒pET-32a-N转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后获得融合N蛋白,SDS-PAGE检测大小约67KD。大部分重组N蛋白以包涵体形式表达,采用金属离子亲和层析方法在变形条件下纯化。实验确定以20mM咪唑浓度的PBS缓冲液为杂蛋白的清洗缓冲液,以100mM咪唑浓度的PBS缓冲液为TEGV重组N蛋白的洗脱缓冲液。纯化后获得了高纯度的N蛋白,SDS-PAGE观察为单一清晰的条带,经核酸蛋白测定仪测定该蛋白浓度为1500μg/ml。免疫印迹实验证明重组N蛋白具有与猪传染性胃肠炎病毒阳性血清反应的反应原性。2、抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体的制备以纯化的TGEV重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞进行融合,融合率达85%(融合率=有杂交瘤细胞生长的细胞培养孔数/总细胞培养孔数)。通过间接ELISA方法对融合细胞进行筛选,阳性率为65%(阳性率=阳性杂交瘤细胞孔数/有杂交瘤细胞生长的细胞培养孔数)。阳性细胞经有限稀释法进行4次亚克隆后,获得了3株能稳定分泌抗重组N蛋白抗体的杂交瘤细胞,分别命名为JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3。间接ELISA检测3株杂交瘤细胞的细胞培养上清和免疫小鼠制备的腹水及血清中的抗体效价均为1:512、1:10~5、1:10~5,且单抗与猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRV)抗原之间均无交叉反应性,间接免疫荧光证实该单抗能与TGEV感染的ST细胞产生特异性免疫荧光,初步证实抗TGEV重组N蛋白单克隆抗体具有良好的特异性,为进一步研究TGEV N蛋白及建立猪传染性胃肠炎的诊断方法提供了条件。