江西部分地区哺乳仔猪含β2毒素基因的A型产气荚膜梭菌分子流行病学调查及拮抗CpA的乳酸杆菌筛选

来源 :江西农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cyc198810
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产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,Cp)是引起家畜动物梭菌性肠炎的重要病原菌之一,因该菌所产生的不同毒素组合依次可以将其分为A、B、C、D、E五种毒素型。其中A和C型产气荚膜梭菌是猪的主要肠道致病菌。以往认为仔猪梭菌性肠炎(Clostridial enteritis of piglets)主要由C型Cp(CpC)引起,近年来,有关A型Cp(CpA)引起仔猪梭菌性肠炎的报道越来越多,该菌分泌的β2毒素在引起新生仔猪肠炎的原因中扮演重要的角色。由于细菌的耐药性问题,对于仔猪梭菌性肠炎的防治越来越困难,而乳酸杆菌对Cp菌有明显的抑制作用。因此本研究内容:(1)对江西地区含β2毒素基因的A型Cp(CpA-β2)在哺乳仔猪中的分子流行情况进行调查;(2)对健康和腹泻哺乳仔猪肠道菌群进行多样性分析;(3)从健康哺乳仔猪肠道内容物筛选拮抗CpA的乳酸杆菌;(4)进行饲料添加类抗生素对CpA的体外抑制试验研究;(5)进行CpA的β2毒素基因克隆与表达试验研究。本研究通过PCR技术手段,建立多重PCR方法检测江西地区哺乳仔猪CpA-β2携带率,结果显示,在255个哺乳仔猪粪样中(健康101和腹泻154),96%(245/255)的样品检测出均只有A型产气荚膜梭菌的存在,而且均携带β2毒素基因;从所有哺乳仔猪粪样分离到的229株产气荚膜梭菌均为A型产气荚膜梭菌,且健康和腹泻哺乳仔猪之间的菌株分离率差异不显著。通过细菌16SrDNA高变区DGGE和高通量测序技术,对健康和腹泻哺乳仔猪肠道菌群结构进行分析,结果显示,腹泻明显影响仔猪肠道菌群多样性,且菌群多样性减少;腹泻哺乳仔猪粪样中梭杆菌属(Fusobacterium)为优势菌群,与健康组比较比例更高(21.78%),而乳杆菌属(Lactobacillus)比例更低(0.12%),这表明梭杆菌属(Fusobacterium)与哺乳仔猪腹泻有很大关系;乳杆菌属(Lactobacillus)对梭杆菌属(Fusobacterium)在哺乳仔猪肠道的定植很可能具有抑制作用。选取乳酸杆菌选择培养基MRS对健康哺乳仔猪粪样进行乳酸杆菌筛选及拮抗CpA试验,并对筛选菌株进行抗逆性试验,最后在212株乳酸杆菌中筛选出3株乳酸杆菌候选菌株,经生化和16SrDNA分子鉴定分别为两株唾液乳酸杆菌和一株植物乳酸杆菌。对临床上多种饲料添加类抗生素进行体外抑制CpA试验研究,结果得出恩拉霉素、喹乙醇和15%杆菌肽锌均有较好的抑菌效果。利用分子克隆实验技术,成功克隆与表达了CpA菌β2毒素基因,重组β2毒素蛋白大小为47kDa。本研究结果表明,CpA与哺乳仔猪腹泻有很大关系,其中β2毒素很可能参与CpA致病引起哺乳仔猪肠炎的过程;乳酸杆菌可能会抑制CpA在哺乳仔猪肠道的定植,筛选得出的3株乳酸杆菌可以用于进一步研究;恩拉霉素、喹乙醇和15%杆菌肽锌能够为临床上预防CpA提供参考价值;重组β2毒素蛋白为进一步研究β2毒素生物学功能及抗体制备奠定了基础。
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