背景与目的创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是世界上造成人类高死亡率和高致残率的重要因素之一,尤其是在儿童和年轻人中,给家庭和整个社会带来了严重的心理问题和经济负担。TBI是一种由于外部机械力对大脑造成的损害,脑外伤幸存者可遗留下短暂或永久的认知功能障碍及其他生理功能的损伤,并产生一系列的心理疾病。它是由原发性损伤和继发性损伤共同作用的高度复杂的疾病。大量研究结果表明,创伤性脑损伤后的继发性损伤,是在原发性损伤造成伤害的基础上对机体造成了进一步的损伤,决定着脑损伤病人的预后和结果。而由于继发性损伤具有一定的延迟性,也可为防止组织的进一步损伤及改善损伤后的功能恢复提供一个治疗的时间窗。众多的临床和实验研究结果表明,创伤性脑损伤在大脑引起的炎症和免疫反应在创伤性脑损伤后的继发性脑损伤中扮演着关键角色。其中,Toll样受体家族(toll like receptors,TLRs)所介导的信号通路在脑损伤过程中尤其重要,Toll样受体家族中的TLR4在TBI后启动炎症反应中起着重要的作用。TLR4信号转导通路主要是激活转录因子IRF3来调节相应的基因转录和髓样分化因子88衔接蛋白依赖性途径,通过与髓样分化因子88衔接蛋白的相互作用激活下游核转录因子(nuclear factorκB,NF-κB),并引起促炎细胞因子和神经毒性的后续生产。TLR4信号转导通路还可以通过髓样分化因子88的激活和相应的下游效应因子使NF-κB的抑制因子IκB磷酸化,从而使NF-κB活化,启动相应的基因转录。NF-κB是最重要的转录因子之一,具有多向性转录激活功能,参与了炎症反应、免疫反应、细胞凋亡等许多生理病理过程。当组织细胞受到外界病理性刺激,TLR4通过信号传递激活NF-κB并使其发生移位,从而导致TLR4/NF-κB信号通路下游的许多炎性因子如IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α、趋化因子等的分泌。我们复制了经典feeney’s自由落体损伤模型,并利用该模型观察脑损伤后大鼠脑组织的病理变化,检测TLR4/NF-κB及其炎性因子IL-1β在创伤性脑损伤中不同时间表达的变化规律,进一步阐明三者在脑挫裂伤后病理生理变化的作用,为临床治疗和法医鉴定提供理论基础。方法成年健康清洁级SD(Sprague-Dawley)大鼠72只,雌雄不限,体重250-300g,由郑州大学实验动物中心提供。所有动物随机分为两组:假手术组12只(免疫组化组和RT-PCR组各6只)仅做常规麻醉开颅,不做颅脑打击;脑损伤组60只,仿制经典feeney’s自由落体损伤模型后分别于第3h、6h、12h、1d、3d和7d各随机选取10只,进行大鼠脑损伤后的行为学观察,并对损伤组大鼠进行神经功能损伤评分后随机分为两组,分别用免疫组化和RT-PCR技术检测TLR4、NF-κB及其介导炎性因子IL-1β的表达。RT-PCR组开颅取脑后,无菌操作下立即取出脑组织置于冰上,观察损伤部位的出血面积,剪取损伤灶周围组织约200g用于脑组织含水量的测定,另外剪取损伤灶周围脑组织约50g,放入冻存管,编号后迅速置于液氮罐中保存,适时提取总RNA,反转录后行RT-PCR检测TLR4 m RNA、NF-κB m RNA及其介导炎性因子IL-1βm RNA的表达。免疫组化组开颅取脑后迅速用4%多聚甲醛液固定24h后常规石蜡包埋切片,利用常规HE染色观察大鼠皮层及海马的形态学变化,并用SP法免疫组织化学技术检测TLR4、NF-κB及其介导炎性因子IL-1β的表达。结果1、大鼠脑损伤后的行为学观察及大鼠颅脑损伤模型结果:本实验颅脑损伤模型共使用SD大鼠60只,其中1只因麻醉意外死亡,2只因打击后出现了呼吸心跳停止而死亡。大鼠在受打击后出现了短暂的昏迷,自主呼吸及心率发生改变,有不同程度的肢体抽搐现象。打击后所有标本损伤处均有硬脑膜下血肿的表现,同时在大鼠颅脑损伤1h后根据Stahel P F等人简化后的神经功能损伤评分对损伤组大鼠对神经功能损伤进行评分,各组大鼠损伤1h后的评分并无明显差别(p<0.05)。2、脑组织含水量的变化:损伤后脑组织可见轻度水肿,其表面颜色不均匀,脑组织含水量在伤后3h可见增加,并呈现逐渐上升的趋势,24h达到高峰,此后开始降低,于7d时仍高于正常水平。3、HE染色结果:损伤组大鼠脑组织的病理变化符合TBI形态特征。镜下可见神经元胞体明显肿胀,结构不清,核固缩,呈不规则形状,细胞周围出现间隙水肿,细胞核变性。4、脑损伤组TLR4的表达在3h已经开始增高,6h至12h持续增高(P<0.05),24h达到高峰,3d至7d开始下降,但也明显高于假手术组(P<0.05)。5、脑损伤组NF-κB表达显著增加,伤后3h后NF-κB活性开始增高(P<0.05),伤后24h NF-κB表达细胞数量显著增加,达到高峰,3d至7d逐渐下降,但仍明显高于对照组的表达量(P<0.05)。6、脑损伤组炎性因子IL-1β的表达在早期迅速增高(P<0.05),于24h达到高峰(P<0.05),3d至7d后开始降低,但仍明显高于对照组(P<0.05)。结论1、大鼠脑损伤后TLR4/NF-κB及其炎性因子IL-1β在脑组织中的表达呈逐渐升高趋势,并在24h达到高峰,之后逐渐下降,呈现出一定的时序性。2、调控TLR4/NF-κB关键环节,降低TLR4、NF-κB的表达或者活性,是防治脑损伤伤后炎症反应的一种方法。3、大鼠脑损伤后TLR4/NF-κB及其炎性因子IL-1β在脑组织中不同时间表达量的变化可作为法医鉴定中的理论依据。