目的:无排卵或排卵障碍性疾病包括中医的月经不调、崩漏、闭经、不孕症等,临床上运用补肾法、疏肝法治疗上述疾病疗效显著。前期及同期实验结果证实:补肾法、疏肝法对排卵障碍模型大鼠性腺轴有很好的调节作用,但是补肾法、疏肝法促进卵巢功能恢复是否通过改善卵巢的血液供应实现的,有待于我们进一步研究。因此,我们建立两种排卵障碍大鼠模型,并应用补肾调经方作为补肾法的代表方剂,逍遥丸作为疏肝法的代表方剂,进行干预。观察比较这两种治疗方法对两种排卵障碍模型大鼠卵巢血管舒-缩因子及血管生成因子的影响,以期从卵巢血液供应方面阐明补肾法和疏肝法促进卵泡发育及排卵作用机制的异同,为临床应用提供实验依据,从而促进中医妇科治疗学的发展。第一部分补肾法对排卵障碍模型大鼠卵巢血液供应的影响方法:建立两种排卵障碍大鼠模型:1.建立雄激素致无排卵大鼠模型,参照俞瑾等方法。即选用同批出生SD雌性大鼠204只,体重约15g。随机取170只于出生第9天颈背部皮下注射丙酸睾丸酮0.05ml/只,第70日龄时阴道脱落细胞涂片,当阴道上皮细胞持续角化时提示模型制作成功。其余34只,于颈背部皮下一次性注射中性茶油0.05ml作为正常对照组。2.建立雷公藤致排卵障碍大鼠模型,改进郑家润,梁文波等方法。三月龄雌性Wistar大鼠204只,体重180-250g,随机取170只大鼠,雷公藤多甙片70mg/kg/d(给药剂量为临床成人用量的20倍,每周称体重,调整给药量),灌胃给药,连续57天。动情周期转为不规则,主要为周期不完整及周期延长,提示模型制作成功。其余34只灌胃给蒸馏水作为正常对照组。3.将两种成模大鼠分别随机分为治疗高剂量组、治疗低剂量组,模型组,另设相应的正常对照组,每组平均34只;第一部分治疗组灌服补肾调经方,模型组和正常组灌服蒸馏水,每日一次。灌胃给药5周,阴道细胞发生周期性变化时进行阴道细胞涂片两个性周期(1个性周期4-5天),最后两天每2小时涂片1次,详细记录各组大鼠的动情周期。最后一次给药后禁食水8小时,依据各组大鼠阴道细胞涂片结果选择动情前期和动情后期,分批断头取血,制备血浆、血清, -20℃保存备检;放免法检测血浆内皮素-1(ET-1)、环磷酸鸟苷(cGMP)水平,硝酸还原酶法检测一氧化氮(NO)水平。同时立即无菌操作,在冰盘上取下左侧卵巢组织,快速、轻轻地投入预冷的光镜固定液小瓶内固定,采用免疫组织化学染色,观察卵巢组织内血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)的表达强度。右侧卵巢组织,吸去血迹,匀浆后采用放免法检测卵巢组织中内皮素-1(ET-1)、血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)、一氧化氮(NO)水平。结果:1补肾法对排卵障碍模型大鼠血浆血管舒-缩因子含量的影响1.1雷公藤致排卵障碍模型1.1.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组ET-1含量均降低,NO、cGMP含量均升高;高、低剂量组之间ET-1、cGMP含量比较,差别均无统计学意义,NO含量比较,低剂量组明显高于高剂量组。1.1.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组ET-1含量均明显降低,NO、cGMP含量均升高;高、低剂量组之间ET-1、NO、cGMP含量比较,差别均无统计学意义。1.2雄激素致无排卵模型1.2.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组ET-1含量均降低,NO、cGMP含量均没有明显变化;高、低剂量组之间ET-1、NO、cGMP含量比较,差别均无统计学意义。1.2.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组ET-1含量均降低,NO含量均没有明显变化,高、低剂量组cGMP含量均升高;高、低剂量组之间ET-1、NO、cGMP含量比较,差别均无统计学意义。2补肾法对排卵障碍模型大鼠卵巢组织血管舒-缩因子含量的影响2.1雷公藤致排卵障碍模型2.1.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织Ang-Ⅱ含量升高,NO含量降低,ET-1含量则无明显变化;与模型组相比,补肾调经方高剂量组ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,低剂量组NO含量升高;高、低剂量组之间卵巢组织Ang-Ⅱ、NO、ET-1含量比较,差别均无统计学意义。2.1.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织ET-1含量升高,NO含量降低,Ang-Ⅱ含量则无明显变化;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组NO含量均升高,ET-1含量均无明显变化,低剂量组Ang-Ⅱ含量降低;高、低剂量组之间卵巢组织ET-1、NO、Ang-Ⅱ含量比较,差别均无统计学意义。2.2雄激素致无排卵模型2.2.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织ET-1、Ang-Ⅱ含量均升高,NO含量降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组Ang-Ⅱ、NO含量均无明显变化,高剂量组ET-1含量降低;高、低剂量组之间卵巢组织ET-1、NO、Ang-Ⅱ含量比较,差别均无统计学意义。2.2.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织ET-1、Ang-Ⅱ含量均升高,NO含量无明显变化;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组Ang-Ⅱ、NO含量均无明显变化,低剂量组ET-1含量降低;高、低剂量组之间卵巢组织ET-1、NO、Ang-Ⅱ含量比较,差别均无统计学意义。3补肾法对排卵障碍模型大鼠卵巢组织血管生成因子表达的影响3.1雷公藤致排卵障碍模型3.1.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间比较,高剂量组VEGF的表达明显高于低剂量组,MVD的表达差别无统计学意义。3.1.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间比较,低剂量组VEGF的表达明显高于高剂量组,高剂量组MVD的表达明显高于低剂量组。3.2雄激素致无排卵模型3.2.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间比较,高剂量组VEGF的表达明显高于低剂量组,MVD的表达差别无统计学意义。3.2.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,补肾调经方高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间VEGF的表达差别无统计学意义,高剂量组MVD的表达明显高于低剂量组。第二部分疏肝法对排卵障碍模型大鼠卵巢血液供应的影响方法:治疗组灌服逍遥丸,其余同第一部分。结果:1疏肝法对排卵障碍模型大鼠血浆血管舒-缩因子含量的影响1.1雷公藤致排卵障碍模型1.1.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组ET-1含量均降低,NO、cGMP含量升高;高、低剂量组之间ET-1、cGMP、NO含量比较,差别均无统计学意义。1.1.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组ET-1含量均降低,NO含量均升高;高剂量组cGMP含量升高;高、低剂量组之间ET-1、NO含量比较,差别均无统计学意义,cGMP含量比较,高剂量组明显高于低剂量组。1.2雄激素致无排卵模型1.2.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量均降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组ET-1含量均降低,cGMP含量均升高,低剂量组NO含量升高;高、低剂量组之间ET-1、NO、cGMP含量比较,差别均无统计学意义。1.2.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组血浆ET-1含量升高,NO、cGMP含量均降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组ET-1含量均降低,cGMP含量均升高,低剂量组NO含量升高;高、低剂量组之间ET-1、cGMP含量比较,差别均无统计学意义,NO含量比较,低剂量组明显高于高剂量组。2疏肝法对排卵功能障碍模型大鼠卵巢组织血管舒-缩因子含量的影响2.1雷公藤致排卵障碍模型2.1.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织Ang-Ⅱ含量升高,NO含量降低,ET-1含量无明显变化;与模型组相比,逍遥丸高剂量组ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,NO含量无明显变化,低剂量组ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量均无明显变化;高、低剂量组之间ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量比较,差别均无统计学意义。2.1.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织ET-1含量升高,NO含量降低,Ang-Ⅱ含量无明显变化;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,NO含量均升高,高、低剂量组之间ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量比较,差别均无统计学意义。2.2雄激素致无排卵模型2.2.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织ET-1、Ang-Ⅱ含量均升高,NO含量降低;与模型组相比,逍遥丸低剂量组ET-1含量降低,高剂量组Ang-Ⅱ含量降低,高、低剂量组NO含量均无明显变化;高、低剂量组之间Ang-Ⅱ、NO含量比较,差别均无统计学意义,ET-1含量比较,低剂量组明显低于高剂量组。2.2.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组卵巢组织ET-1、Ang-Ⅱ含量均升高,NO含量无明显变化;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,NO含量均无明显变化;高、低剂量组之间Ang-Ⅱ、NO含量比较,差别均无统计学意义,ET-1含量比较,高剂量组明显低于低剂量组。3疏肝法对对排卵功能障碍模型大鼠卵巢组织血管生成因子表达的影响3.1雷公藤致排卵障碍模型3.1.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间VEGF、MVD的表达差别均无统计学意义。3.1.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间比较,高剂量组VEGF的表达明显高于低剂量组,MVD的表达差别无统计学意义。3.2雄激素致无排卵模型3.2.1对模型大鼠动情前期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间VEGF、MVD的表达差别均无统计学意义。3.2.2对模型大鼠动情后期的影响与正常组相比,模型组VEGF、MVD的表达均降低;与模型组相比,逍遥丸高、低剂量组VEGF、MVD的表达均升高;高、低剂量组之间VEGF、MVD的表达差别均无统计学意义。第三部分补肾法、疏肝法对排卵障碍模型大鼠卵巢血液供应的比较研究方法:同第一部分、第二部分结果:1两法对排卵障碍模型大鼠血浆血管舒-缩因子水平影响的比较1.1雷公藤致排卵障碍模型1.1.1对模型大鼠动情前期的影响补肾调经方与逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠ET-1含量降低,NO、cGMP含量升高;逍遥丸高、低剂量组ET-1、cGMP含量与补肾调经方高、低剂量组相比,差别均无统计学意义;逍遥丸高、低剂量组NO含量明显高于补肾调经方高剂量组。1.1.2对模型大鼠动情后期的影响补肾调经方与逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠ET-1含量降低,NO含量升高,补肾调经方高、低剂量和逍遥丸高剂量均可使模型大鼠cGMP含量升高;逍遥丸低剂量组ET-1含量明显低于补肾调经方高、低剂量组;逍遥丸低剂量组NO含量明显低于补肾调经方高剂量组;逍遥丸高、低剂量组cGMP含量与补肾调经方高、低剂量组相比,差别均无统计学意义。1.2雄激素致无排卵模型1.2.1对模型大鼠动情前期的影响补肾调经方高、低剂量均可使模型大鼠ET-1含量降低,NO含量升高,高剂量可使模型大鼠cGMP含量升高;逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠ET-1含量降低,cGMP含量升高,低剂量可使模型大鼠NO含量升高;逍遥丸高、低剂量组ET-1含量与补肾调经方高、低剂量组相比,差别无统计学意义;逍遥丸低剂量组NO含量明显高于补肾调经方高剂量组;逍遥丸高、低剂量组cGMP含量均明显高于补肾调经方高、低剂量组。1.2.2对模型大鼠动情后期的影响补肾调经方高、低剂量均可使模型大鼠ET-1含量降低,但NO、cGMP含量较模型组均没有明显变化;逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠ET-1含量降低,cGMP含量升高,低剂量可使模型大鼠NO含量升高;逍遥丸高、低剂量组ET-1含量与补肾调经方高、低剂量组相比,差别无统计学意义;逍遥丸低剂量组NO含量明显高于补肾调经方低剂量组;逍遥丸高、低剂量组cGMP含量均明显高于补肾调经方高、低剂量组。2两法对排卵障碍大鼠卵巢组织血管舒-缩因子水平影响的比较2.1雷公藤致排卵障碍模型2.1.1对模型大鼠动情前期的影响补肾调经方高剂量可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,低剂量可使模型大鼠NO含量升高;逍遥丸高剂量可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量均降低,NO含量较模型组无明显变化,低剂量组ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量较模型组均无明显变化;逍遥丸高、低剂量组与补肾调经方高、低剂量组间卵巢组织ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量比较差别无统计学意义。2.1.2对模型大鼠动情后期的影响补肾调经方高、低剂量均可使模型大鼠NO含量升高,ET-1含量较模型组均无明显变化,低剂量可使模型大鼠Ang-Ⅱ含量降低;逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量降低,NO含量升高;逍遥丸高、低剂量组与补肾调经方高、低剂量组卵巢组织ET-1、Ang-Ⅱ、NO含量比较差别无统计学意义。2.2雄激素致无排卵模型2.2.1对模型大鼠动情前期的影响补肾调经方高、低剂量组Ang-Ⅱ、NO含量较模型组均无明显变化,高剂量可使模型大鼠ET-1含量降低;逍遥丸低剂量可使模型大鼠ET-1含量降低,高剂量可使模型大鼠Ang-Ⅱ含量降低,高、低剂量组NO含量均较模型组无明显变化;逍遥丸高、低剂量组NO、Ang-Ⅱ含量与补肾调经方高、低剂量组相比,差别无统计学意义;逍遥丸低剂量组ET-1含量明显低于补肾调经方低剂量组。2.2.2对模型大鼠动情后期的影响补肾调经方高、低剂量组Ang-Ⅱ、NO含量较模型组均无明显变化,低剂量可使模型大鼠ET-1含量降低;逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠ET-1、Ang-Ⅱ含量降低,高、低剂量组NO含量较模型组无明显变化;逍遥丸高、低剂量组Ang-Ⅱ含量均明显低于补肾调经方高剂量组;逍遥丸高剂量组ET-1含量明显低于补肾调经方高、低剂量组;逍遥丸高、低剂量组与补肾调经高、方低剂量组NO含量比较差别均无统计学意义。3两法对排卵障碍模型大鼠卵巢组织血管生成因子表达影响的比较3.1雷公藤致排卵障碍模型3.1.1对模型大鼠动情前期的影响补肾调经方与逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表达升高;逍遥丸高、低剂量组VEGF的表达均明显高于补肾调经方高、低剂量组;MVD的表达明显高于补肾调经方低剂量组。3.1.2对模型大鼠动情后期的影响补肾调经方与逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表达升高;逍遥丸高、低剂量组VEGF的表达均明显高于补肾调经方高、低剂量组;逍遥丸高剂量组MVD的表达明显高于补肾调经方低剂量组。3.2雄激素致无排卵模型3.2.1对模型大鼠动情前期的影响补肾调经方与逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表达升高;逍遥丸高、低剂量组VEGF、MVD的表达均明显高于补肾调经方低剂量组。3.2.2对模型大鼠动情后期的影响补肾调经方与逍遥丸高、低剂量均可使模型大鼠VEGF、MVD的表达升高;逍遥丸高、低剂量组与补肾调经方高、低剂量组VEGF的表达,差别均无统计学意义。逍遥丸高、低剂量组MVD的表达明显高于补肾调经方低剂量组。结论:1两种排卵障碍模型大鼠血管舒缩因子平衡失调,卵巢局部供血障碍,影响了卵巢的功能,导致了排卵障碍的发生。补肾调经方和逍遥丸均可使血管舒张因子NO、cGMP活性增强,血管收缩因子ET-1、Ang-Ⅱ活性降低,使血管舒缩恢复正常,从而改善卵巢局部血液供应,增强卵巢功能,促进卵泡的发育及排卵。2两种排卵障碍模型大鼠卵巢组织VEGF表达减弱,MVD降低,血管生成调节障碍。补肾调经方和逍遥丸均可使卵巢组织VEGF表达增强,MVD升高,促进血管生成,改善卵巢局部血液供应,调节卵巢的功能。3疏肝法在调节血管舒缩平衡、促进血管生成,改善卵巢血液供应方面优于补肾法。