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急性肝损伤（Acute Liver Injury,ALI）是肝脏常见疾病之一,可由肝炎病毒感染、药物滥用、膳食补充剂、毒物、放化疗药物及不断涌现的新药等因素引起;可造成肝功能指标异常升高,且多出现肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润和血窦扩张等病理特征。若治疗不及时可发展为急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）,严重威胁人民的身体健康和生命安全,其所面临的严峻现状亟待解决。目前,ALI发病机制仍未明确,因此探讨ALI的病理生理机制对临床防治ALI具有重要意义。近年来,大量研究表明,ALI进展的各阶段均检测出氧化应激标志物和氧化应激敏感细胞因子的大量表达,如丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）等,由此说明,氧化应激在ALI进展中发挥至关重要的作用。MDA和ROS是氧化应激的主要标志物,OPN是氧化应激敏感细胞因子,均在ALI的进展过程中扮演着重要角色,可激活与氧化应激关联密切的丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）信号通路。因此,若在肝脏疾病的进程中抑制MAPK信号通路的活化状态或可有效预防ALI。尾加压素Ⅱ（UrotensinⅡ,UⅡ）与其G蛋白偶联受体14（G protein coupled receptor 14,GPR14）构成的UⅡ/UT系统,具有多种生物学效应,如收缩、扩张血管,影响物质代谢以及胶原合成,其广泛存在于肝脏、心脏、血管内皮、脾脏、肺脏以及肾脏等器官中。大量研究发现,当发生肝脏疾病时,UⅡ/UT系统呈高度活化状态,其可作为肝损伤治疗的特异性靶点。而多肽类化合物Urantide是目前公认最有效的UⅡ受体拮抗剂,可有效地抑制UⅡ/UT系统的生物学功能。肝损伤的发生与发展同MAPK信号通路异常激活存在着密切关系,抑制该通路激活或可有效预防ALI的进程。前期研究发现,UⅡ与其受体结合,可激活JAK2/STAT3信号通路,经Urantide干预后可有效抑制该通路的激活,有效预防ALI的发生与发展;而Urantide拮抗UⅡ/UT系统后是否可通过调控MAPK信号通路发挥预防ALI的作用呢?因此,本文以ALI大鼠为研究对象,基于MAPK信号通路,探讨及分析多肽类化合物Urantide是否可预防CCl4引起的ALI,并阐述其具体作用机制。目的:本研究以MAPK信号通路为切入点,探究Urantide拮抗UⅡ/UT系统后是否通过调控该信号通路发挥预防ALI的保护作用,研究Urantide与该信号通路上下游通路蛋白及氧化应激标志物MDA、ROS和氧化应激敏感细胞因子OPN之间的关联性,分析和研究UⅡ/UT系统与MAPK信号通路蛋白级联关系以及多肽类化合物Urantide抗ALI的作用,并阐明其具体作用机制,为将其开发成针对MAPK信号通路新型靶向药物提供有效的实验数据。方法:1.按照随机化原则将大鼠分为:对照组、ALI模型组、异甘草酸镁（Magnesium isoglycyrrhizinate,Mg IG）组、Urantide组（5mg/Kg、10mg/Kg、20mg/Kg）,共6组,其中ALI模型组10只,其余每组各8只。在基础饮食一周后禁食24h,对照组和ALI模型组连续一周每日尾静脉注射生理盐水（20mg/Kg）、Mg IG组连续一周每日尾静脉注射Mg IG（20mg/Kg）、Urantide各组连续一周每日分别给药Urantide 5mg/Kg,10mg/Kg和20mg/Kg。大鼠末次给药后,禁食2h,对照组腹腔注射1ml/Kg橄榄油;其余各组均腹腔注射50%四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）橄榄油混合溶液（1ml/Kg）。2.全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）指标;3.苏木精＆伊红染色（H＆E染色）观察各组大鼠肝组织的形态学变化;4.油红O染色观察大鼠肝组织脂肪变性情况;5.TBA法测定大鼠肝组织MDA含量,化学荧光法测定各组大鼠肝组织ROS含量;6.免疫荧光染色法检测各组大鼠肝组织中p-JNK、p-ERK1/2和p-P38的蛋白表达及定位;7.实时荧光定量PCR法（RT-q PCR）检测各组大鼠肝组织中OPN、JNK、ERK1/2和P38 m RNA的表达;8.Western blotting检测各组大鼠肝组织中UⅡ、GPR14、OPN、p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38和P38蛋白表达水平;9.数据用均数±标准差表示,并采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。结果:1.ALI模型组大鼠血清ALT、AST表达水平明显高于对照组（P＜0.01）;与ALI模型组相比,Urantide各给药组大鼠血清中AST、ALT表达水平均下调。ALI模型组的肝重和肝指数显著高于对照组（P＜0.01）,说明CCl4可引起肝重和肝脏的脏器指数改变。Urantide给药10mg/Kg和20mg/Kg组预防效果较为明显,大鼠肝重和肝指数均低于ALI模型组（P＜0.01或P＜0.05）。2.H＆E染色结果表明:ALI模型组镜下可见肝细胞出现细胞水肿、重度脂肪变性、点状坏死和炎性细胞浸润特征,结构破坏严重且血窦扩张等病理变化。Urantide各给药组肝组织病理变化得到有效改善。肝脏病理评分显示:ALI模型组的病理评分显著高于对照组（P＜0.01）。与ALI模型组相比,经Urantide预防给药后,大鼠肝脏病理评分显著下调（P＜0.01）。3.油红O染色结果表明:ALI模型组镜下可见整个肝脏呈现重度脂肪变性。Urantide各给药组大鼠肝脏的脂肪变性逐渐减轻。肝脏脂肪变性面积结果显示:ALI模型组的脂肪变性面积显著高于对照组（P＜0.01）。与ALI模型组相比,经Urantide预防给药后,大鼠肝脏脂肪变性面积显著下调（P＜0.01）。4.大鼠肝组织MDA和ROS结果显示:与对照组相比,注射CCl4显著增加大鼠肝组织MDA水平（P＜0.01）。然而,大鼠预防给药Urantide后,MDA水平显著下降（P＜0.01）。表明Urantide能有效减轻CCl4诱导的生物膜脂质过氧化。与对照组相比,注射CCl4显著增加大鼠肝组织ROS水平（P＜0.01）,CCl4处理后造成肝脏对ROS清除能力降低,细胞内大量ROS产生和堆积,促使生物膜发生脂质过氧化,进而引起氧化应激。预防给药Urantide能显著降低ROS的活性（P＜0.01）。这表明Urantide通过减轻CCl4引起的氧化应激而保护肝脏免受损伤。5.免疫荧光染色结果表明:对照组大鼠肝脏中MAPK信号通路相关蛋白p-JNK、p-ERK1/2和p-P38少量表达;ALI模型组大鼠肝脏中p-JNK、p-ERK1/2和p-P38蛋白表达在诱导后增加,蛋白表达主要见于大鼠肝脏变性、坏死肝细胞胞质。而Urantide给药后,大鼠p-JNK、p-ERK1/2和p-P38的表达水平降低。6.RT-q PCR结果表明:与对照组相比,ALI模型组大鼠肝组织中OPN、JNK、ERK1/2和P38的m RNA表达上调（P＜0.01）;而Urantide各组OPN、JNK、ERK1/2和P38的m RNA表达水平呈明显的下调趋势（P＜0.01）。7.Western blotting结果表明:与对照组相比,ALI模型组大鼠肝组织中UⅡ、GPR14、OPN、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2和p-P38/P38蛋白水平均明显升高（P＜0.01）;而Urantide各组UⅡ、GPR14、OPN、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2和p-P38/P38蛋白表达下调（P＜0.01或P＜0.05）。结论:多肽类化合物Urantide给药后,血清学指标ALT、AST以及肝重和肝指数下调,肝脏的病理损伤得到显著改善。同时发现,Urantide可下调ALI大鼠肝脏中UⅡ、GPR14蛋白表达,降低氧化应激标志物MDA、ROS和氧化应激敏感细胞因子OPN以及MAPK信号通路相关基因和蛋白的表达水平。综上所述,Urantide可通过拮抗UⅡ/UT系统而抑制MAPK信号通路的激活,提高大鼠的抗氧化应激能力和保护肝脏的作用。