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布鲁氏菌病（Brucellosis）由布鲁氏菌引起的一种在世界范围内流行的人畜共患细菌病,严重威胁着人和动物的健康,影响畜牧业发展和社会公共卫生安全。目前在畜牧业中主要依靠接种弱毒疫苗进行布病预防,但因无法有效区分布鲁氏菌疫苗免疫和强毒株感染造成的抗体阳性,给布病净化带来一定的困难。白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）作为一种促炎细胞因子在宿主抵抗病原微生物入侵和防御感染的过程中发挥重要作用。本课题组前期研究构建了强、弱毒株布鲁氏菌感染羊白细胞层抑制性消减杂交（SSH）c DNA文库,并筛选获得差异表达基因IL-1β,进一步检测发现不同毒力布鲁氏菌感染可引起IL-1β在转录和翻译水平差异表达。因此,本研究利用猪种布鲁氏菌弱毒株S2（attenuated Brucella suis strain S2）感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,分析IL-1β差异表达特点,并通过改变IL-1β蛋白水平分析巨噬细胞内布鲁氏菌寄生数量,以期揭示宿主炎症因子IL-1β对布鲁氏菌胞内寄生的影响。1.小鼠IL-1β编码区DNA克隆、表达及多抗隆抗体制备利用分子生物学技术克隆小鼠IL-1β编码区DNA,构建IL-1β原核表达载体p ET-28a-IL-1β,诱导表达并纯化重组蛋白,并通过胸腺细胞增殖实验检测纯化的重组蛋白的生物活性,制备兔源多克隆抗体。最终获得特异性良好的多克隆抗体和具有生物活性的IL-1β重组蛋白。2.布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞IL-1β差异表达分析为了分析布鲁氏菌侵染过程中宿主IL-1β在转录和翻译水平上的变化趋势,本实验利用猪种布鲁氏菌弱毒株S2侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以灭活S2处理、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌侵染组作为对比分析组,感染复数为（Multiplicity of infection,MOI）为100:1（细菌:细胞）。通过RT-q PCR检测在细菌侵染过程中IL-1βm RNA转录水平变化;Western blot分析胞内IL-1β蛋白翻译水平变化;ELISA检测胞外分泌IL-1β水平变化。结果显示,细菌感染（包括灭活S2处理）可以迅速引起IL-1β转录水平升高;胞内IL-1β的蛋白表达量在布鲁氏菌感染12小时和李斯特菌感染8小时后开始明显升高,而其它组一直表现为较高水平;胞外IL-1β分泌量在布鲁氏菌感染组和李斯特菌感染组均一直维持高于正常对照组的含量水平,而大肠杆菌组和灭活S2处理组的胞外IL-1β含量先高于正常对照组,之后下降至与正常未侵染组无明显差异。3.改变IL-1β蛋白含量水平对布鲁氏菌胞内寄生的影响本实验将IL-1β的干扰RNA或过表达载体转染巨噬细胞,降低或升高胞内IL-1β蛋白表达水平,以及通过外源添加活性IL-1β蛋白,提高胞外IL-1β含量,利用菌落平板计数方法分析IL-1β蛋白水平变化对胞内布鲁氏菌荷菌量的影响。结果显示,IL-1β含量变化与布鲁氏菌胞内荷菌量无明显相关性,未见其影响布鲁氏菌的胞内寄生。荧光定量PCR结果显示,此过程中LAMP1、i NOS、My D88和TRAF6等基因也无差异表达变化。4.My D88过表达对布鲁氏菌感染的影响My D88是IL-1β、IL-1α等细胞因子的胞内信号转导的关键分子。在巨噬细胞中转染构建的My D88过表达载体,通过菌落平板计数方法分析胞内布鲁氏菌活菌数的变化,探讨My D88过表达对布鲁氏菌胞内寄生的影响。结果显示,过表达My D88可降低布鲁氏菌的胞内荷菌量,同时LAMP1、i NOS、Caspase-1和TRAF6基因转录上调表达,Rab7转录显著下调,Hex B转录水平与未转染组相比无显著性差异,胞外IL-1β分泌量增加,表明My D88与布鲁氏菌的胞内寄生密切相关。综上所述,本研究发现巨噬细胞IL-1β差异表达与布鲁氏菌的胞内寄生无明显相关性;My D88作为胞内重要的信号转导分子,其上调表达引起胞内布鲁氏菌荷菌量减少,结合现有文献研究报道,进一步证明My D88有助于胞内布鲁氏菌的清除,但这种作用可能不是通过IL-1β与IL-1R结合激活My D88依赖途径实现的,其机制还有待进一步研究。