背景GSK3一种丝氨酸蛋白激酶,在多种细胞内信号通路中发挥核心作用,包括由Wnt/β-catenin,sonic hedgehog,Notch,生长因子/受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体激活的那些通路。在哺乳动物中,GSK3由两个同源基因GSK3α和GSK3β编码,它们的激酶结构域内的氨基酸序列约90%相同。以前的研究表明,GSK3α和GSK3β在调节Wnt/β-catenin信号通路中具有重叠功能。另一方面,敲除GSK3α和GSK3β在小鼠中产生不同的表型。虽然GSK3β敲除导致胚胎致死,但GSK3α敲除小鼠是活的并且在肝糖原代谢中仅有轻微缺陷。这些结果表明两种GSK3同工酶在发育过程中具有非冗余的作用,但其基础尚不清楚。GSK3是一种有吸引力的药物靶点,因为GSK3活性的失调与多种疾病的发病机制有关,GSK-3对神经发育的多个方面的重要性,包括神经祖细胞自我更新,神经发生,神经元迁移,神经分化和突触发育。然而,个体GSK3同工酶在这些疾病的发病机理中的作用尚不清楚。我们实验室之前研究表明CHIR作为非选择性抑制可以促进胚胎来源神经干细胞的体外培养的长期自我更新。通过使用Sox1作为小鼠早期NSCs的标记,筛选比较了生长因子和不同小分子的组合,发现NSCs可以通过激活bFGF信号通路并结合GSK-3的抑制剂CHIR99021来稳定地自我更新。这些NSCs可以从单个细胞克隆扩增。更重要的是,相较于既往神经干细胞培养方案,本实验室培养方案保留了高效的神经元分化能力,并表现出对前脑和中脑区域的特异性。虽然此方案培养的胚胎来源神经干细胞具有强大的细胞增殖能力,但仍会出现部分神经干细胞的分化现象,表现后期Sox1阴性。本研究设想一种方案可以更加稳定高效维持Sox1阳性的神经干细胞。我们实验室之前应用Chemical-Genetic方法,发现在小鼠的胚胎干细胞中,GSK3β的选择性抑制足以维持小鼠ESC自我更新,而GSK3α抑制却促进小鼠ESC向神经谱系分化。提示全基因组转录分析显示GSK3α和GSK3β具有不同的下游靶标组。因此本实验旨在探讨单独抑制两种同工酶在神经干细胞的自我更新和分化中的作用及寻找更加有效的神经干细胞分化及培养方案。由于目前还没有可以很好地区分两种同工酶的小分子抑制剂。了解GSK3α和GSK3β差异调节细胞过程的机制将来可以建立更加高效的神经干细胞体外培养方案,并促进更具体的药物的开发,以靶向单个GSK3同工酶,用于治疗由GSK3活性失调引起的各种疾病。通过基因敲除的方法研究GSK3同工酶的方案可能导致非常不同的结果。因为基因敲除可以改变蛋白质结构,从而造成研究结果的偏倚。我们实验室在之前的研究发现在小鼠胚胎干细胞中,通过基因敲除的方法敲掉GSK3α或GSK3β,对方可以相互替代其功能。如果不通过基因敲除的方法而通过一种全新的Chemical-Genetic实现GSK3α或GSK3β单独抑制,由于对方没有丧失功能结构,对方无法替代其功能,从而实现对GSK3两种同工酶不同作用机制的研究。在这里在这里,我们表明GSK3α和GSK3β可以使用chemical-genetic方法选择性抑制。第一部分抑制Gsk3α和GSK3β在神经干细胞发育中的作用目的:研究非选择性抑制和选择性抑制在神经干细胞发育中的作用方法:使用单层分化方案将ES细胞转化为Sox1^GFP阳性神经干细胞,并对神经干细胞进行体外长期培养及鉴定。对神经干细胞分别进行CHIR非选择性抑制和选择性抑制来探讨GSK3在神经干细胞发育中的作用,同时比较非选择性抑制和选择性抑制的不同作用。结果:1.小鼠ES细胞在mESC培养基中接种到明胶包被的6孔板上。第二天撤去LIF,每隔2天更换不含LIF培养基。4天后在荧光显微镜下可见Sox1^GFP阳性神经干细胞。6天后达到高峰。此阶段神经干细胞可在N2B27培养液中用ABC（cocktail）进行体外培养并保持自我更新,期间用puromycin筛选1周可得到99%以上的Sox1^GFP阳性神经干细胞。2.通过免疫染色和qPCR检查NSC特异性分子标志物的表达水平。除了Sox1之外,其他NSC特异性标志物（包括Sox2,巢蛋白和Pax6）在长期自我更新的NSCs中均有表达,这些细胞还显示出一些玫瑰花结特异性标记物的阳性染色,包括ZO1和PLZF,结果证实了在我们的培养条件下,神经干细胞处于Rosettes阶段,并能保持稳定的自我更新。3.神经干细胞在N2B27培养基中接种到laminin包被的6孔板上,撤除ABC,每2天更换一半培养基,神经干细胞将在7-10天内分化为具有神经突的神经元细胞,也会有极少量星形胶质细胞。在此培养条件下,99%神经干细胞分化TUJ1阳性（未成熟神经元）,1%分化为星形胶质细胞（Astrocyte）。4.在bFGF存在下,CHIR对GSK3非选择性抑制能够能显著提高神经干细胞的细胞增殖。同时提高长期培养中神经干细胞SOX1阳性比例,使神经干细胞维持在早期阶段。5.在bFGF存在下,全面抑制Gsk3α和GSK3β比分别单独抑制更加显著提高NSC的增殖。单独抑制GSK3β比单独抑制Gsk3α在提高细胞增殖方面更加显著。单独抑制GSK3β较CHIR全面抑制GSK3更能提高神经干细胞SOX1阳性比例,并能在长期培养中稳定维持,而单独抑制Gsk3α无明显作用。6.撤除bFGF情况下,分别单独抑制GSK3β可促进NSC的神经突形成,CHIR全面抑制GSK3则可抑制轴突形成。单独抑制GSK3β可促进NSC的神经分化,并更易向Neuron方向分化。第二部分过表达Gsk3α和GSK3β在神经干细胞发育中的作用目的:研究过表达Gsk3α和GSK3β在神经干细胞发育中的作用方法:采用第一部分提及的神经干细胞诱导及培养方案,转染过表达质粒的神经干细胞在含有ABC cocktail的N2B27培养基中培养。接种神经干细胞到laminin包被的6孔板上。分别加入DOX后2天进行免疫荧光检测。分别选择性过表达Gsk3α和GSK3β探讨其在神经干细胞发育中的作用。结果:1.分别将GSK3α和GSK3β加入DOX后在N2B27分化3天。然后将细胞进行TUNEL测定。TUNEL阳性细胞的数量在对照组,GSK3α和GSK3β各组之间是相当的,表明细胞凋亡没有显着影响。FACS分析检查了GSK3同种型对NSC增殖的影响。对照组,GSK3α和GSK3β组分别加入DOX2天后,测量RFP⁺NSC数量的变化。在所有三组中,第2天RFP⁺细胞的数量加倍至相似水平,三组之间没有显着差异。这些数据表明GSK3不影响NSC的增殖潜力。分别过表达GSK3α和GSK3β对于神经干细胞增殖和凋亡没有影响。2.过表达GSK3β抑制NSCs神经分化,而过表达GSK3α在一定程度上促进NSCs神经分化。选择性过表达GSK3β抑制NSCs神经分化。如增加NESTIN表达,减少TUJ1的表达。在仅用表达RFP的对照载体转导的细胞中,⁵0%的RFP阳性细胞对TuJ1呈阳性。在GSK3α转导的细胞中观察到较高水平的TuJ1阳性细胞,为61%,而在GSK3β转导的细胞中该水平降低至20%。与对照相似,约38%的GSK3α转导的细胞对NESTIN呈阳性。然而,GSK3β的过表达使Nestin阳性细胞的百分比增加至75%。。我们发现在神经干细胞中过表达GSK3α产生相对于过表达GSK3β相反的趋势,虽然这一差别不如过表达GSK3β明显,我们仍然看到了过表达GSK3α增加了TuJ1的表达（P<0.01）。3.过表达GSK3β抑制神经分化,促使“玫瑰花结样”细胞向扁平状细胞分化。免疫荧光染色显示其特征性P75,我们利用差别消化法分离这两种形态的细胞,qRT-PCR提示扁平细胞为神经嵴细胞。过表达GSK3β促使NSCs向神经嵴细胞分化。结论:GSK3β而不是GSK3α的选择性抑制可促进神经干细胞神经方向分化。GSK3β过度表达可抑制神经干细胞神经方向分化,而促进神经嵴细胞方向分化。未来开发针对GSK3β的小分子药物可以提高早期神经干细胞体外的自我更新。我们的研究为在各种细胞过程中定义GSK3同工酶特异性功能开辟了新的途径,并证实GSK3在神经发育过程中的不同作用。