FOXO1通过拮抗相互作用蛋白MYH9抑制鼻咽癌干性和侵袭转移的研究

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研究背景:鼻咽癌是一种高发于中国华南地区的特殊的恶性头颈部肿瘤。在临床中,鼻咽癌的主要死亡原因与肿瘤早期转移,复发和化疗耐药相关。FOXO1是一个经典的抑癌基因,然而其在鼻咽癌中调控肿瘤转移的机理研究并不深入,在鼻咽癌肿瘤干性方面的作用并不明确。研究内容和方法:1.探索FOXO1对鼻咽癌细胞生物学功能的影响及其具体分子机制(1)构建稳定转染FOXO1的鼻咽癌细胞;荧光定量PCR和Western blot实验鉴定过表达和干扰效率;(2)肿瘤球形成实验,Transwell实验,划痕实验等体外功能实验和极限稀释法皮下荷瘤模型,肺转移模型等体内动物实验观察FOXO1对鼻咽癌细胞干性,侵袭转移的影响;(3)利用Western blot实验检测FOXO1对β-catenin,P53,TCF4,ZEB1,c-Myc,OCT4,E-Ca,N-Ca和Vimentin蛋白表达的影响。2.鉴定FOXO1相互作用蛋白(1)质谱分析实验和蛋白免疫共沉淀实验筛选出可能与FOXO1相互作用的蛋白;(2)蛋白免疫共沉淀(Co-IP)实验结合Western blot实验在内源性和外源性验证与FOXO1相互作用的蛋白;(3)免疫荧光实验观测鼻咽癌细胞中FOXO1与其相互作用蛋白的共定位;(4)荧光定量PCR和Western blot实验探究FOXO1与相互作用蛋白在鼻咽癌细胞中的表达调控关系;3.探索直接靶向MYH9的miRNA(1)生物信息学预测靶向MYH9 3’UTR的miRNA;(2)荧光定量PCR实验和蛋白质免疫实验验证miRNA对MYH9的调控作用;(3)双荧光素酶报告实验确证miRNA靶向MYH9;(4)多种体外功能实验观察miRNA在FOXO1抑制鼻咽癌肿瘤干性、转移侵袭和促进化疗敏感性过程中的作用;(5)Western blot实验检测miRNA在FOXO1调控相关因子蛋白水平表达过程中的作用;4.探索miR-133a-3p上游转录因子(1)生物信息学预测转录调控miR-133a-3p的转录因子;(2)荧光定量PCR实验验证转录因子对miR-133a-3p的调控作用;(3)染色质免疫沉淀(ChIP)检测转录因子与miR-133a-3p启动子区域的结合;(4)EMSA实验验证转录因子与miR-133a-3p启动子区域的结合;(5)双荧光素酶实验验证预测转录结合位点的转录活性;(6)Western blot实验检测P53下游相关蛋白表达量;(7)多种体外功能实验观察P53在FOXO1抑制鼻咽癌肿瘤干性、转移侵袭和促进化疗敏感性过程中的作用;(8)Western blot实验检测P53在FOXO1调控相关因子蛋白水平表达过程中的作用;5.分析FOXO1与MYH9在鼻咽癌组织中的表达特性与相关性(1)荧光定量PCR实验,免疫组化实验及相关统计分析探究FOXO1的临床表达特征;(2)荧光定量PCR实验,免疫组化实验及相关统计分析探究MYH9的临床表达特征;(3)FOXO1与MYH9的相关性分析;(4)单因素和多因素分析探究鼻咽癌患者独立影响因素;结果(1)FOXO1在体内和体外水平抑制鼻咽癌肿瘤干性,转移侵袭及促进化疗敏感性;(2)FOXO1与MYH9相互作用,并在转录后水平抑制MYH9表达:(3)miR-133a-3p 直接靶向 MYH9;(4)P53 转录抑制 miR-133a-3p;(5)FOXO1在鼻咽癌组织中相对低表达,与患者预后正相关;MYH9在鼻咽癌组织中相对高表达,与患者预后负相关;FOXO1与MYH9表达负相关;FOXO1是独立预后因素。结论FOXO1通过调控P53/miR-133a-3p信号轴抑制其相互作用蛋白MYH9的表达,进而抑制MYH9下游的β-catenin/TCF4/ZEB1通路,最终发挥抑制鼻咽癌肿瘤干性、侵袭转移及促进化疗敏感性的作用。
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